VAKSIN GINGSENG TRANSGENIK UNTUK BOVINE VIRAL DIARRHEA

Yugang Gao, Xueliang Zhao, Chao Sun, Pu Zang, He Yang, Ran Li, & Lianxue Zhang

Abstrak
Latar Belakang: Infeksi bovine viral diarrhea virus (BVDV) merupakan infeksi endemic
pada populasi sapi di dunia dan sebagai penyebab kerugian ekonomi. Sehingga, diperlukan
vaksin yang efektif untuk melawan penularan dari BVDV. Glikoprotein adalah protein
amplop pada virus dan berkaitan dengan imunogenitas BVDV. Dilaporkan bahwa
penggunaan Panax ginseng sebagai bahan produksi alternative untuk pengekspresian
glikoprotein dengan menggunakan transformasi media Agrobacterium.
Hasil: Analisis dari Polymerase chain reaction (PCR) dan reverse transcription (RT)-PCR
menunjukan bahwa pBI121- terintegrasi secara stabil pada kromosom transforman
(Agrobacterium). Pengujian kadar logam ELISA dan Western blot analysis menunjukan
antigenisitas glikoprotein dari tumbuhan. Imunogenitas dievaluasi menggunakan ekstrak
protein dari rambut akar gingseng transgenic kering. Hormon spesifik dan respon imun
terhadap BVDV terdeteksi setelah imunisai.
Kesimpulan: Hasil menunjukan bahwa glikoprotein dapat diekspresikan oleh rambut
akar gingeseng dan glikoprotein dari tumbuhan dan mempertahankan antigenisitas dan
imunogenisitas dari glikoprotein .

Pendahuluan
Bovine viral diarrhea virus (BVDV) adalah virus RNA yang berasal dari family
Flaviviridae dan merupakan penyebab kerugian ekonomi pada ternak di dunia. Infeksi BVDV
menyebabkan beberapa dampak seperti infeksi akut, diare, masalah fertilitas, dan penyakit
mukosa fatal. Infeksi BVDV dapat menyebabkan kerusakan sistem imun hewan yang
terinfeksi dan membuat hewan ternak menjadi lebih rentan terhadap penyakit lainnya. Selain
itu, BVDV dapat ditularkan antar berbagai jenis hewan seperti sapi, kambing, dan rusa ekor
putih and keberadaan BVDV pada spesies hewan domestic lainnya dapat sesuai dengan
epidemologinya. Tingkat infeksi BVDV pada rusa muda mencapai 60 86,7% di beberapa
wilayah China, yang menyebabkan kerugian ekonomi di insutri rusa sika yang disebabkan
oleh tingginya kematian dan infeksi janin yang berkaitan dengan penyakit tersebut. Pada
penelitian sebelumnya rantai tunggal BVDV, bernama CCSYD telah diisolasi dan
diverifikasi berasal dari rusa sika. Infeksi BVDV pada rusa sika menjadi perhatian serius dan
diperlukan strategi yang efektif untuk melawan penularan BVDV.
Vaksin telah diketahui sebagai alat efektif yang digunakan untuk pemberatasan
patogen hewan yang ekonomis. Terdapat beberapa vaksin komersial yang tersedia untuk
melawan bovine viral diarrhea (BVD) tetapi menunjukan hasil yang tidak normal.
Imunogenitas yang rendah dari vaksin BVDV inaktif kadang menyebabkan kegagalan imun.
Meskipun modifikasi vaksin hidup telah menyediakan proteksi terhadap strain yang
homolog, resiko instrinsik dari pembalikan virulensi masih menjadi hal yang perlu
diperhatikan. Sehingga penggunaan vaksin subunit rekombinan menjadi alternative untuk
menghadapi permasalahan tersebut.
Genom BVDV ditranslasi dan diproses menjadi 11 protein termasuk satu protein
kapsid (C), satu protease terminal N (Npro), tiga glikoprotein amplop (E1, E2, dan ),
satu protein 7 kDa (p7), dan 5 protein non-struktural (NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, dan
NS5B). Setelah infeksi atau vaksinasi, sapi akan memproduksi antibodi untuk melawan tiga
protein ampop virus (E1, E2, dan ) dan melawan satu protein non-struktural (NS2-3).
Glikoprotein E2 merupakan target utama dari antibody netralisis pada inang yang terinfeksi
BVDV. Tetapi, protein E2 kadang akan menyebabkan kegagalan imunisasi.
Glikoprotein merupakan salah satu protein structural virus. Beberapa penelitian
mengindikasikan bahwa beberapa epitope yang relevan secara imunologi melimpah di
antara isolate BVDV yang berbeda, dan terdapat beberapa perbedaan ditemukan pada
komposisi asam amino di antara persivirus yang berbeda-beda. Sebagai protein yang
melimpah, BVDV telah digunakan sebagai antigen untuk deteksi serologi BVDV.
BVDV terekspresikan pada sistem prokariot yang juga memproduksi antibody penetralisir,
tetapi antibody penertralisir tersebut diproduksi dalam jumlah yang sedikit sehingga sulit
untuk menertralisir virus secara efisien. Hal tersebut terjadi karena berada dalam kondisi
misfolding atau konfigurasi yang tidak tepat ketika diekspresikan pada sel prokariot.
Karena ekspresi eukariotik dapat mempertahankan konfigurasi yang tepat dan
glikosilasi protein, ekspresi eukariotik menjadi fokus penelitian mengenai vaksin subunit.
Gao et al telah mengontruksi vector ekspresi prokariot PVAX1-E0 dan menunjukan bahwa
PVAX1-E0 dapat memproduksi hormon spesifik dan respon imun seluler pada kelinci.
Tetapi, vaksin subunit tersebut hanya memberikan imunitas jangka pendek. Tumbuhan
transgenic adalah sistem pengembahan ekspresi gen pada eukariot yang telah menjadi
bioreactor yang menarik dalam produksi peptide dan protein medis yang bernilai tinggi.
Vaksis berbasis tumbuhan memberikan beberapa keuntungan dibandingkan vaksin
konvensional, yaitu keuntungan berupa pengembangan yang mudah, keberhasilan mucosal,
aman, skalabilitas yang cepat, dan harga yang murah. Sehingga, beberapa spesies tumbuhan
telah digunakan sebagai sistem pengembangan antigen untuk vaksin subunit. Contohnya,
potongan glikoprotein BVDV E2 yang diekspresikan pada daun Nicotiana tabacum dan
kemudian menunjukan reaktivitas yang tinggi terhadap uji netralisasi virus.
Cara lainnya untuk meningkatkan aktivitas imun pada vaksin adalah menggunakan
adjuvant. Adjuvant vaksin dapat menstimulasi sistem imun untuk meningkatkan respon
antibody spesifik. Panax ginseng yang umunya dikenal sebagai ginseng telah digunakan
sebagai tumbuhan obat di Asia Timur sejak 2000 tahun lebih. Fungsi utama dari ginseng
adalah menstimulasi resistensi alami dalam melawan infeksi. Beberapa penelitian
menunjukan bahwa ekstrak ginseng dapat menghasilkan beberapa efek dalam sistem imun
seperti peningkatan aktivitas fagositas makrofag, meningkatkan proliferasi limfosit,
menstimulus produksi sitokinin, dan meningkatkan aktivitas neutrophil, sel T 4+ , dan sel
natural killer.

Metode
1. Alat dan bahan
Plasmid pBI121- dan Agrobacterium rhizogenes A4 diperoleh dari logistic
laboratorium peneliti. Enzim restriksi, Taq DNA polimerasa, TriPure Kit, dan T4 ligase
dibeli dari TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China) dan digunakan untuk membentuk
plasmid pBI121- rekombinan. Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer)
dikembangbiakan di Jilin Agricultural University (China).
2. Bioetika
Semua rusa diperoleh dari DongDa Deer Industry Co., Ltd. Perawatan dan pemeliharaan
dilakukan di peternakan rusa sika Jilin Agricultural University dan perizinan penelitian
ini telah diberikan oleh Management Bureau of Animal Husbandry di Provinsi Jilin.
Semua rusa dirawat sesuai dengan peraturan perawatan rusa sika dan peraturan tersebut
telah disetujui oleh DongDa Deer Industry Co., Ltd. Keselamatan hewan dan prosedur
percobaan dilakukan berdasarkan Protocol Guide GB/T 14926.50-2001, yang telah
disetujui oleh Standartization Administration of the Peoples Republic of China.
Penelitian ini juga telah disetujui oleh komite etika hewan Jilin Agriculture University
dan National Der Industry Association of China Animal Agriculture Association
(CAAA). Semua rusa telah dianestesi sebelum di-sampling. Pengambilan sample darah
dilakukan oleh dokter hewan, ahli biologi, atau teknisi dengan pengalaman pelatihan
mengenai prosedur tersebut. Diambil hingga 2 mL darah rusa dari pembuluh darah di
leher. Proses operasi dilakukan dengan sedasi sodium pentobarbital dan dilakukan untuk
mengurangi sakit. Akhirnya, tidak ada satu pun rusa yang mati.
3. Konstruksi Plasmid
Total RNA dari sel MBDK yang terinfeksi dengan CCSYD BVDV (yang merupakah
bagian dari BVDV) yang telah diisolasi dan telah mengalami transkripsi balik dengan
menggunnakan primer hexa-random. Amplifikasi bagian menggunakan primer
forward (5-CCG GAT CCA TGG AAA ACA TAA CAC AGT GG-3, bagian yang
ditandai BamHI) dan menggunakan primer reverse (5-GCG AGC TCT TAA GCG TAT
GCT CCA AAC CAC GT-3, bagian yang ditandai SacI). Hasil PCR dikonstruksi dengan
BamHI dan SacI dan disisipkan ke pBI121 vektor yang dikonstruksi oleh enzim yang
sama untuk membuat plasmid pBI121- rekombinan. Vector rekombinan yang
diperoleh dimasukan ke dalam Agrobacterium rhizogenes 4 dengan elektroporesis
menggunakan prosedur yang sebelumnya telah dijelaskan.
4. Kultivasi Strain Agrobacterium rhizogenes
Strain Agrobacterium rhizogenes 4 yang mengandung pBI121- ditambahkan ke
medium kultur padat YEB dan diaktivasi sebanyak 3 kali pada suhu 27C. Satu koloni
diisolasi dari cawan kemudian diinokulasikan ke dalam 2mL medium kultur cair YEB
dan diinkubasi semalaman dengan di-shaking ada kecepatan 110 rpm pada suhu 27C.
5. Penyiapan Eksplan
Rhizome ginseng yang berusia 2 tahun dibersihkan dengan air mengalir selama 1 2 jam,
sterilisasi permukaan, dan dilakukan disinfektanisasi dengan perendaman selama 30 detik
pada etanol 75%. Pembersihan eksplan diakhiri dengan diberi perlakukan HgCl2 (0.1%)
selama 6-8 menit dalam kondisi aseptic dan kemudian dicuci dengan air suling sebanyak
5 kali untuk menghilangkan sisa HgCl2 . Kemudian, rhizome steril dipotong menjadi
potongan-potongan berukuran 2-3 mm dan dibiakan pada medium Murashige dan Skoog
(MS) selama 2 hari sebelum dilakukan transformasi.
6. Prosedur Transformasi
Tranformasi dengan media Agrobacterium rhizogenes dilakukan. Setelah kultivasi selama
1 hingga 2 bulan, akar-akar mulai muncul pada daerah yang terinfeksi dan diambil 1
rambut akar untuk kemudian disimpan pada medium MS dengan kanamycin (500 mg/L)
untuk menghilangkan bakteri. Rambut akar yang telah steril dari bakteri dikultur pada
medium padat MS bebas hormon dalam kondisi gelap dan suhu 26C. Rambut akar
disubkultur dengan interval 4 minggu. Rambut akar Panax ginseng transgenic diverifikasi
dengan PCR dan RT-PCR menggunakan primer forward 5-CCG GAT CCA TGG AAA
ACA TAA CAC AGT GG-3 dan primer reverse 5GCG AGC TCT TAA GCG TAT
GCT CCA AAC CAC GT-3. Eksplan ginseng diinfiltrasi dengan Agrobacterium
rhizogenes wild-type A4 untuk memeperoleh control negative.
7. Ekstraksi Protein
Isolasi protein dilakukan dengan menggunakan 0,5 g rambut akar ginseng transgenic yang
kemudian digiling dalam nitrogen cair. Dihasilkan bubuk yang diresuspensikan pada 1
mL ekstrak buffer (125 mM Tris-Cl pH 6.8, 4 mol/L urea, 4% SDS, dan 5% -
mercaptoethanol) dan campuran yang dihasilkan disentrifuge pada 12,000 x g selama 20
menit pada suhu 4C. Konsentrasi protein dalam 1 mL supernatant dideteksi dengan uji
kadar logam protein Bradford menggunakan albumin serum bovine (BSA) sebagai
standar.
8. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
ELISA dilakukan untuk mendeteksi keberadaan glikoprptein pada rambut akar
transgenic. Secara garis besar proses ELISA, ekstrak rambut akar diinkuasi pada pelat
ELISA semalam dengan suhu 4C, kemudian pencucian dengan PBST, dan
pemblokingan dengan serum kuda 10% selama 1 jam pada suhu 37C. Setelah kembali
dilakukan pencucian dengan PBST, antiserum anti-BVDV (pengenceran 1:20) digunakan
sebagai antibody primer. Kemudian pelat diinkubasi selama 1 jam pasa suhu 37C dengan
peroksida lobak / horseradish peroxidase (HRP) yang berkonjugasi dengan anti-bovine
kelinci IgG (pengenceran 1:5,000) sebagai antibody sekunder. Reaksi diberhentikan
setelah 5 menit dengan 2 M 2 4 (50 L/well) dan absorbandi diuji menggunakan
ELISA reader 490 nm.
9. Western blot analysis
Larutan protein dari control dan tumbuhan transgenic dianalisis dengan Western blot
analysis. Ekstrak total protein soluble dari rambut akar ginseng transgenic segar
dielektroforesis pada sodeium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE) dan
ditransfer ke membran nitroselulosa. Western blotting assay dilakukan dengan
menggunakan antiserum anti-BVDV (1:100 pengenceran) sebagai antibody primer dan
anti-bovine kelinci yang terkonjugasi dengan HRP (pengenceran 1:5,000) sebagai
antibody sekunder. Analisis dilakukan dengan alat SuperSignal West Pio.
 10. Jadwal Imunisasi
40 ekor sika jantan berusia 1 bulan secara acak dibagi menjadi 5 kelompok (masing-
masing 8 rusa perkelompok). Rambut akar ginseng transgenic dan yang belum
ditransformasi direndam dalam larutan salin selama 24 jam. Kemudian, ekstrak disaring
dengan membran mikroporus 0.22 m untuk sterilisasi. Kelompok 1 diimunisasi dengan
1 mL ekstrak dari rambut akar ginseng transgenic (setara dengan 0.1 g rambut akar
ginseng transgenic). Kelompok 2 diimunisasi dengan 1 mL ekstrak rambut akar ginseng
yang tidak ditransformasi. Kelompok 3 diimunisasi dengan 50 vaksin BVDV inaktif.
Kelompok 4 diimunisasi dengan 100 50 vaksin BVDV inaktif dan 1 ml ekstrak
rambut akar ginseng yang tidak ditransformasi. Kelompok 5 diimunisasi dengan 1 mL
garam sebagai kelompok control negative. Imunisasi ke-2 dilakukan pada seluruh
kelompok pada hari ke-14 setelah imunisasi awal. Sample darah diamabil pada imunisasi
pertama dan pada hari ke-7, seterusnya dengan interval 7 hari hingga hari ke-42 setelah
imunisasi pertama.
11. Determinasi Antibodi Spesifik pada Rusa
Uji ELISA dilakukan untuk menguji keberadaan antibody spesifik pada serum darah pada
rusa yang telah diimunisasi. Darah diambil dari rusa yang kemudian diencerkan (1:40)
pada buffer (pH 8) dan ditambahkan plat mikrotiter. Plat mikrotiter diinkubasi selama 2
jam pada suhu 37C. Setelah dihilangkan cairannya, plat dibersihkan 3 kali dengan PBST,
dan diblok dengan serum kuda 10% selama 2 jam pada suhu 37C. Kemudian, 100L
antigen virus (mengandung 100g protein viral) diekstrak dari 24 BVDV ditambahkan
pada plat dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37C. Setelah itu, plat diberishkan dan
diblok seperti langkah di atas. Absorbandi diuji dengan menggunakan pembaca ELISA
490 nm.
12. Lymphocyte blastogenesis assay
Sel mononuklir peripheral darah diisolasi dari darah anti-koagulan dan viabilitas sel diuji
dengan uji kadar logam trypan blue dye exclusion. Nilai keberlangsungan hidup >95%
dipertimbangkan sebagai kuantifikasi. Suspensi sel ditempatkan pada plat berdasar bulat
pada konsentrasi 5 106 sel/plat (100 L). Kemudian plat diinkubasi dengan atau tanpa
BVDV. Metode MTT digunakan untuk mendeteksi viabilitas sel. Diuji dengan absorbansi
570 nm.

Hasil
1. Analisis genetik tumbuhan tranform
Rambut akar ginseng transgenic diperoleh. Setelah isolasi DNA genom dan RNA total
dari rambut akar ginseng transgenic, diperoleh pita sepanjang 706 bp dengan
menggunakan PCR dan reverse transcription (RT)-PCR pada seluruh rambut akar
ginseng kecuali pada kelompok control negative, hal tersebut menunjukan integrasi yang
stabil dari vector pBI121- pada kromosom tumbuhan transform.

2. Ekspresi protein pada rambut akar ginseng transgenic

Untuk menentukan terekspresinya protein pada rambut akar ginseng transgenic,
pertama dilakukan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi
keberadaan antigen dalam total protein soluble dari rambut akar ginseng transgenic. Hasil
menunjukan bahwa protein soluble dari kelompok ginseng transgenik memiliki
reaktivitas imun terhadap antiserum anti-BVDV dan nilai 490 dari kelompok
transgenic memiliki nilai tinggi dibanding dengan kelompok control negative, yang
menunjukan bahwa protein diekspresikan dan terakumulasi pada Panax ginseng
transgenic.
Untuk menentukan imunogenitas dari protein soluble kelompok control terhadap
antiserum anti-BVDV, dilakukan Western blot analysis. Hasil menunjukan bahwa signal
spesifik terdeteksi dalam total protein soluble dari tumbuhan transgenic terpilih setelah
dilakukan immunoblotting dengan antiserum anti-BVDB, sementara tidak ada signal yang
teramati dari kelompok non-transform. Hasil menunjukan bahwa protein
terekspresikan pada rambut akar ginseng transgenic yang bersifat imunoreaktif terhadap
antiserum anti-BVDV.
3. Deteksi serum antibody rusa dan tingkat imun seluler
 Sample serum antibody rusa digunakan untuk menguji level antibody pada rusa yang
terimunisasi. Nilai OD meningkat setelah dilakukan imunisasi dengan seluruh kelompok
vaksin, kecuali pada kelompok control. Level antibody dari grup 3 dan 4 meningkat
secara berkelajutan, meningkat hingga mencapai puncak di hari ke-11 setelah inokulasi
kedua. Hewan yang tervaksinasi dari kelompok 1 menunjukan tingkat antibody yang
tinggi di mana level antibody mencapai puncak pada hari ke-18 setelah inokulasi kedua.
Tidak terdapat peningkatan level antibody yang signikan pada kelompok control negative
(P>0,05). Hasil tersebut menunjukan bahwa vaksin tumbuhan transgenic (kelompok 1)
dapat menghasilkan respon imun hormon spesifik pada rusa.
Serum dikumpulkan pada saat imunisasi dan pada hari ke-42 setelah imunisasi serum
akan dilakukan deteksi imun sel mediasi. Hasil menunjukan terdapat peningkatan
proliferasi simfosit pada kelompok yang diberi perlakuan dengan vaksin rambut akar
ginseng transgenic, vaksin BVDV inaktif, dan pada kelompok vaksin BVDV inaktif +
exstrak rambut akar ginseng yang belum ditransformasi dengan antigen BVDV. Tidak
terdapat proliferasi spesifik yang terdeteksi pada kelompok control (kelompok 2 dan 5).
Hasil tersebut menunjukan proliferasi limfosit fitohemaglutin (PHA)-induced dan
menunjukan bahwa protein terekspresi pada rambut akar ginseng transgenic dapat
memperpanjang respon imun sel mediasi dalam melawan antigen BVDV.

Diskusi