1

”KLONING GEN PUTATIVE CLEAVAGE PROTEIN 1 (PCP-1) PADA UDANG

VANAME (Litopenaeus vannamei) YANG TERSERANG INFECTIOUS
MYONECROSIS VIRUS”

MAKALAH

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Bioteknologi Hewan

Dosen : Muh. Amrullah Pagala, S.Pi, M.Si

Oleh :

IRMAYANTI (F1E1 17 026)

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2018
 2

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL …………………………………………………… 1

DAFTAR ISI …………………………………………………………… 2

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang ………………………………………………... 3

B. Tujuan Makalah ………………………………………………. 4

BAB II MATERI DAN METODE

A. Materi ………………………………………………………….. 5

B. Metode …………………………………………………………. 6

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil dan Pembahasan ………………………………………... 7

BAB IV PENUTUP

A. Kesimpulan …………………………………………………….. 9

DAFTAR PUSTAKA 10

LAMPIRAN
 3

I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penanggulangan penyakit udang dapat dilakukan dengan mengunakan

obat dan antibiotika akan tetapi penggunaan obat dan antibiotika ini menimbulkan

resistensi bakteri dan residu antibiotika pada udang tersebut. Salah satu alternatif

penanggulangan penyakit udang yang ramah lingkungan yaitu peningkatan sistem

kekebalan tubuh (immunity) ikan melalui program akan tetapi karena udang (dan

hewan invertebrate lain) mempunyai sistem kekebalan tubuh yang sangat primitif

yang berbeda dengan sistem kekebalan tubuh ikan.

Udang tidak mempunyai immunological memory, seperti sel limfosit B

pada ikan dan mamalia sehingga sistem kekebalan tubuh udang tidak dapat

dirangsang dengan pembiakan pemberian vaksin konvensional seperti pada ikan.

Pada virus udang pennon-aktifan gen (gene silencing) dilakukan dengan cara

mengganggu fungsi gen yang vital untuk proses replikasi virus misalnya gen viral

protein 28 (VP28) pada white spot syndrome virus (WSSV), gen RdRp

(RNAdependent RNA polymerase) pada yellow head virus (YHV) dan gen

putative cleavage protein 1 (PCP-1) pada IMNV. Gen PCP-1 adalah gen yang

berfungsi dalam pembentukan capsid dan proses transkripsi RNA IMNV.

Kloning adalah suatu tindakan dimana bertujuan untuk menggandakan

atau mendapatkan keturunan jasad hidup tanpa fertilisasi yang berasal dari induk

yang sama serta mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan

kemungkinan besar mempunyai fenotip yang sama. Kloning ini merupakan suatu
 4

terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang mungkin dibutuhkan untuk

manusia, meliputi serangkaian proses isolasi fragmen DNA spesifik dari genom

suatu organisme.

1.2 Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan kloning gen putative

cleavage protein 1 yang digunakan dalam rangka perakitan teknologi RNAi untuk

pengendalian penyakit IMNV pada udang vaname.

 5

BAB II
MATERI DAN METODE

2.1 Materi

2.1.1 Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)

Udang vaname memiliki karakteristik spesifik seperti mampu hidup

pada kisaran salinitas yang luas, mampu beradaptasi terhadap lingkungan

bersuhu rendah, dan memiliki tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.

Udang vaname memiliki nafsu makan yang tinggi dan dapat memanfaatkan

pakan dengan kadar protein rendah, sehingga pada sistem budidaya dengan

pola semi intensif biaya pakan dapat diminimalisir. Keunggulan yang

dimiliki tersebut, jenis udang ini sangat potensial dan prospektif untuk

dibudidayakan

2.1.1 Kloning Gen

Kloning memiliki dua arti yaitu penggandaan sekuen tertentu dari DNA

sehingga menghasilkan DNA yang identik dan pengisolasian sekuen tertentu

dari DNA suatu organisme atau sel untuk diperbanyak pada organisme atau

sel berbeda. Metode kloning umumnya mengikuti lima tahap meliputi (1)

pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease yang

memiliki situs pemotongan tertentu (2) memilih DNA 5ector yang memiliki

kemampuan bereplikasi secara otonom seperti yang dimiliki oleh virus dan

plasmid (3) menggabungkan secara kovalen potongan DNA dengan DNA

5ector menggunakan enzim ligase sehingga menghasilkan DNA rekombinan

 6

(4) memasukkan DNA rekombinan tersebut ke dalam sel inang yang

memiliki enzim-enzim yang dibutuhkan DNA rekombinan untuk bereplikasi

(5) menyeleksi sel inang yang mengandung DNA rekombinan.

2.2 Metode

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1. Isolasi RNA Total

2. Sintesis cDNA dan Amplifikasi PCR

3. Isolasi Fragmen DNA dari dan Purifikasi Produk PCR

4. Transformasi, Seleksi dan Perbanyakan Koloni Bakteri Terinsersi Gen

PCP1

5. Verifikasi Hasil Isolasi Plasmid dengan PCR

6. Sekuensing dan Analisis Data

 7

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Isolasi RNA Total dan Sintesis cDNA

RNA total dari organ target udang vaname yang terinfeksi IMNV telah

berhasil diekstraksi dan disintesis menjadi cDNA dengan panjang fragmen

target DNA 379 bp setelah dikonfirmasi dengan PCR. Teramplifikasinya

cDNA dengan primer IMNV95F dan IMNV474R dengan ukuran 379 bp

menunjukkan bahwa sintesis cDNA total melalui proses transkripsi balik telah

menghasilkan pita tunggal. Sampel DNA dikatakan spesifik dan berhasil

diamplifikasi apabila hasil analisis elektroforesis menunjukkan terdapatnya

pita tunggal DNA dengan ukuran sesuai berdasarkan penanda yang telah

diketahui sebelumnya

2. Transformasi pada Bakteri E. coli Top 10

Keberhasilan transformasi dievaluasi menggunakan metode seleksi

koloni biru putih. Proses transformasi telah berhasil dilakukan yang

ditunjukkan dengan tumbuhnya transforman koloni putih bakteri E. coli TOP

10 pada media-media seleksi yang mengandung 7ector7tic ampisilin + Xgal.

Koloni putih yang tumbuh pada media seleksi merupakan E. coli TOP 10 yang

mengandung insersi atau yang membawa gen target PCP-1, sedangkan koloni

yang berwarna biru merupakan E. coli yang tidak mengandung insersi

3. Verifikasi Hasil Isolasi Plasmid dengan PCR

Seleksi melalui Verifikasi PCR koloni untuk memastikan adanya sisipan

gen PCP–1 pada plasmid rekombinan yang juga menunjukkan proses

 8

transformasi ini telah berhasil dilakukan. PCR koloni menggunakan primer

IMNV95F dan IMNV474R, dengan hasil fragmen DNA berukuran 379 bp.

Hal ini menunjukkan bahwa semua koloni bakteri yang berwarna putih dalam

master plate membawa plasmid dengan insersi DNA gen PCP–1.

4. Analisis Hasil Sekuen dari Purifikasi Plasmid

Hasil sekuensing menunjukkan kesejajaran (alignment) nukleotida

dengan program BLAST antara hasil sekuen dari produk plasmid dengan

sekuen yang ada di Genebank. Sekuensing yang dilakukan dua arah

menghasilkan sekuen DNA yang berukuran 379 bp. Analisis melalui BLASTn

menunjukkan bahwa gen yang tersisip dalam plasmid p®2.1 merupakan

fragmen gen PCP-1. Persentase tingkat homologi sekuen nukleotida

ditunjukkan dengan kemiripan hasil penjajaran sekuen yang terlihat dari nilai

identitas. Peranan suatu gen dalam pengendalian suatu penyakit pada ikan

dapat dipelajari melalui pendekatan dua arah, yaitu meningkatkan ekspresi gen

dengan mengkonstruksi 8ector over expression, serta menghentikan atau

menurunkan ekspresi gen antara lain dengan mengkonstruksi RNAi (RNA

interference). Dengan mengkonstruksi RNAi dari gen PCP-1 diharapkan hasil

yang diperoleh dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan untuk

mempelajari dan mengaplikasikan kandidat antivirus RNAi dalam

pengendalian penyakit IMNV

 9

BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Kesimpulan pada penelitian ini adalah Gen putative cleavage protein 1

(PCP-1) dari udang vaname yang terserang Infectious Myonecrosis Virus berhasil

dikloning, berdasarkan hasil isolasi plasmid cDNA PCP-1 yang menunjukkan

semua koloni bakteri terseleksi membawa plasmid hasil insersi DNA gen PCP–1.

Analisis kesejajaran urutan nukleotida menunjukkan bahwa cDNA dari gen PCP-

1 nilai homologinya mencapai 100% dan 99% dengan sekuen di Genebank yaitu

identik dengan sekuen dari Brazil dan Indonesia.

 10

DAFTAR PUSTAKA

Novita, H., Sunarto, A dan Andriyanto, S., 2016, Kloning Gen Putative Cleavage
Protein 1 (Pcp-1) pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei) yang
Terserang Infectious Myonecrosis Virus, Jurnal Media Akuakultur, 11(1):
27-33.