LEMBAR KERJA MAHASISWA

METABOLISME DAN INFORMASI

GENETIK

KONTRUKTIVISME LIMA FASE NEEDHAM

PROBLEM BASED LEARNING
DISUSUN OLEH: MADE SUKARYAWAN
Kelompok 4 Palembang
- Anggi Septiani (06101381924040)
- Mira Rahmawati (06101381924046)
- Miranda Ayu Rahmadini (06101381924052)
 PERTEMUAN 13
KLONING GEN

1. ORIENTASI MASALAH

Bacalah materi dan amatilah video pembelajaran pertemuan 13, yang telah disajikan, Dari
tayangan tersebut pahamilah apa yang dimaksud dengan cloning? Apa syarat-syarat cloning gen?
untuk apa melakukan cloning gen?
Link Video : https://youtu.be/tK2H0KGvKh4
Jawab :
Kloning berasal dari bahasa Inggris” cloning” yang berarti suatu usaha untuk menciptakan
duplikat suatu organisme melalui proses aseksual atau dengan arti lain, membuat fotokopi atau
pengadaan dari suatu makhluk hidup dengan cara aseksual. kloning adalah perbanyakan sel atau
organisme secara aseksual. Hasil kloning adalah klon, yakni populasi yang berasal dari satu sel
atau organisme yang mempunyai rangkaian kromosom yang sama dan sifat yang identik
dengan induk asalnya. Klon diartikan sebagai kumpulan organisme baik tanaman maupun
hewan yang mengandung perangkat gen yang sama. Proses perbanyakan salinan DNA interest
disebut dengan kloning gen.

Syarat-syarat Kloning Gen

Komponen dan syarat-syarat dalam kloning gen yaitu:

a. DNA yang terdiri dari 2 atau lebih ( DNA rekombinan)

b. Sumber DNA
Sumber DNA untuk pengerjaan kloning dapat berupa DNA kromosom yang diisolasi
dari inti sel ataupun DNA komplementer yang diperoleh dari penyalinan mRNA dengan bantuan
enzim reverse transcriptase, disebut complementary DNA (cDNA).
c. Adanya vektor
Vektor merupakan wahana pembawa fragmen gen target ke dalam suatu sel inang. Persyaratan
utama suatu molekul DNA dapat digunakan sebagai vektor, antara lain harus mampu disisipi
DNA asing, dapat diintroduksi ke dalam sel inang, dapat bereplikasi secara independen di dalam
sel inang, dan memiliki penanda seleksi. Vektor yang sering digunakan untuk penelitian kloning
dalam sel bakteriadalah virus dan plasmid. Vektor lain yang dapat digunakan dalam kloning
adalah kosmid, fagemid, bacterial artificial chromosome (BAC), dan yeast artificial chromosome
(YAC).
 d. Enzim endonuklease restriksi
Enzim endonuklease restriksi yang diisolasi dari bakteri merupakan enzim yang dapat memotong
ikatan fosfodiester untai DNA asing pada sekuen pengenalan yang spesifik.
e. Enzim ligase
Enzim merupakan mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan fosfodiester antara
potongan fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling berkomplemen hasil
pemotongan dengan enzim ligase enzim yang restriksi.
f.Adanya sel inang
Bakteri seperti E. coli, merupakan mikroorganisme yang sangat bermanfaat dalam kloning karena
memiliki karakteristik ideal sebagai sel inang bagi gen yang akan dikloning, antara lain mudah
dimanipulasi, mampu tumbuh dengan cepat dan stabil pada medium kultur biasa, non-patogen,
serta dapat ditransformasi DNA asing.

Tujuan Kloning Gen

Kloning gen dilakukan untuk menyalin suatu gen untuk mendapatkan sifat unggul tertentu dari
suatu spesies. Kloning bertujuan memperbanyak dan mengisolasi DNA yang disisipkan pada
DNA vektor.

Selain itu, tujuan dari klonning gen yaitu:

 Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
 Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

 Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

 Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit
bawaan

 Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan

terhadap hama

2. PENCETUSAN IDE

Berdasarkan pengamatan saudara diskusikan dengan kompok saudara hal-hal berikut ini:
Buatlah tabel bahan-bahan yang digunakan untuk cloning gen dan apa fungsinya masing-
masing?
 Jawab :

Komponen Kloning Fungsi

DNA donor (insert) Sumber dari DNA atau gen yang di klon, salah
satunya berasal dari mikroba laut.
Endonuclease Restriksi Enzim digunakan untuk memotong DNA donor
dan vektor pada lokasi spesifik sehingga DNA
donor dapat disambungkan ke dalam vektor.
Vektor Plasmid atau bakteriofage yang digunakan untuk
mengintroduksi Gen untuk diklonkan ke dalam
suatu sel inang yang cocok.
DNA Ligase Enzim yang digunakan untuk menggabungkan
ujung sambungan (splice) dari vektor dan DNA
donor, kemudian membentuk suatu vektor
rekombinan.
Sel Inang (Host Cell) Biasanya suatu bakteri atau yeast. Tempat
diintroduksikan vektor rekombinan ke dalam sel
inang.

3. PENSTRUKTURAN IDE

Dari pencetusan ide tersebut diskusikan dalam kelompok saudara: Bagaimana tahapan cloning gen?
Bagaimana seleksi cloning gen?

Jawab :

Tahapan Kloning Gen

Tahapan-tahapan dalam mengkloning suatu gen adalah sebagai berikut:

a. Isolasi fragmen DNA

Isolasi fragmen DNA yang spesifik dapat dilakukan dengan metode PCR (polymerase chain
reaction) yaitu teknik amplikasi fragmen DNA yang spesifik secara in vitro. Secara umum DNA
yang digunakan untuk PCR adalah total DNA genom yang diekstraksi dari sel dan tidak
membutuhkan tingkat kemurnian tinggi. Urutan DNA yang akan diamplikasi secara spesifik akan
ditentukan oleh primer-primer yang tersusun dari nukleotida.
 Material yang diperlukan untuk proses PCR adalah DNA yang mengandung rangkaian urutan
yang akan diperbanyak (duplikasi DNA) yaitu primer, DNA polimerase dan campuran dari empat
macam deoksiribonukleotida-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) serta MgCl2.
b. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
Penyisipan fragmen DNA atau gen target ke dalam DNA vektor untuk membentuk molekul DNA
rekombinan melibatkan 2 tahap, yaitu digesti serta ligasi DNA vektor dan gen target sisipan.
Vektor dan sisipan didigesti dengan enzim restriksi yang sama sehingga keduanya memiliki
potongan kohesif (sticky ends) serupa yang akan saling berlekatan. Enzim ligase mengkatalisis
proses perlekatan basa-basa nukleotida yang saling berkomplemen. Ligasi biasanya terjadi antara
ujung gugus fosfat dengan gugus hidroksil. Ligasi antara fragmen DNA yang memiliki ujung
lengket (cohesive ends) yang komplementer jauh lebih efesien dibandingkan dengan ujung
tumpul (blunt ends). Efisiensi ligasi juga dipengaruhi oleh adanya deoksiadenosin tunggal pada
ujung.

c. Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang

Tahap lanjutan pada kloning gen setelah pembuatan molekul DNA rekombinan (vektor yang
disisipi gen sisipan) adalah introduksi DNA rekombinan ke dalam sel inang. Sel inang akan
tumbuh dan membelah membentuk banyak koloni yang mengandung DNA target. Introduksi
DNA vektor plasmid yang mengandung gen sisipan ke dalam sel inang bakteri disebut
transformasi; sedangkan introduksi vektor virus dinamakan transfeksi). Sel inang terlebih dahulu
dibuat menjadi kompeten sebelum dilakukan proses transformasi sehingga menjadi permeabel
terhadap DNA asing. Sel kompeten dapat dibuat dengan memberikan perlakuan fisik atau kimia
yang akan meningkatkan kemampuan sel untuk mengikat dan mengambil DNA.
d. Seleksi hasil kloning
Keberhasilan proses kloning dapat diketahui dengan melakukan seleksi. Melalui proses seleksi,
koloni transforman yang membawa DNA rekombinan target (berhasil dikloning) dapat dibedakan
dari koloni transforman yang tidak membawa DNA target. Proses seleksi dapat dilakukan
dengan sejumlah metode, seperti hibridisasi DNA probe, hibridisasi antibodi monoklonal, dan
metode yang umum digunakan adalah seleksi antibiotik dan a-komplementasi (blue-white
screening).
 Seleksi Kloning Gen dengan Blue-White Screening
Salah satu metode seleksi kloning gen adalah blue-white screening. Seleksi biru putih (blue-
white screening) adalah metode yang digunakan untuk mengetahui plasmid yang rekombinan dan
yang tidak rekombinan, yang dilakukan untuk mengaahui keberhasilan proses ligasi atau
keberadaan fragmen sisipan. Metode ini menggunakan media yang meflgandung X-Gal dan
IPTG (Isopropyl Thiogalaktosida). X-Gal adalah molekul yang mirip galaktosida, IPTG
berfungsi sebagai penginduksi ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi sebagai substrat.
Transforman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan putih. Koloni yang berwarna putih
adalah koloni bakteri rekombinan yang mengandung fragrnen sisipan yang dapat dikatakan
bahwa proses ligasi dan transformasi dinyatakan berhasil. Koloni bakteri yang berwama putih
merupakan koloni rekombinan. Jika proses ligasi atau penyambungan fragmen DNA tidak
berhasil ditandai dengan warna koloni berwarna biru.

4. APLIKASI

Jika salah satu fragmen DNA hasil dari pemotongan

Enzim Restriksi Bam H1 pada pertemuan 12, di cloning
dengan vector pUC 19. Rancanglah proses cloning
tersebut. Analisislah seleksi rekombinan pada proses
tersebut.
Jawab :

Sequens DNA: 5’ATGGCTCGGCCCTCAAGTCGAGGTTATCAGAACTGCAACTCATATGATCGA

GAGGGAAATCAATTCTGTGAACGATAATCCAGTCATTGATGTTGCCAGAGAC AAAGCT 3’
3’TACCGAGCCGGGAGTTCAGCTCCAATAGTCTTGACGTTGAGTATACTAGCT
CTCCCTTTAGTTAAGTCACTTGCTATTAGGTCAGTAACTACAACGGTCTCTGT TTCGA 5’
Ketika urutan DNA tersebut direaksikan dengan enzim restriksi BamH1 (dengan sekuens pengenalan
GGATCC) maka tidak terjadi pemotongan fragmen DNA. Hal ini disebabkan karena pada urutan
DNA tersebut tidak ditemukan urutan sisi pengenalan pemotongan dari enzim BamH1. Karena tidak
terdapat fragmen DNA hasil dari pemotongan enzim retriksi Bam H1 pada sekuens DNA tersebut,
maka rancangan proses cloning dengan
vector pUC19 dan hasil analisis seleksi rekombinan pada proses tersebut tidak dapat ditemukan.

5.REFLEKSI

Buatlah kesimpulan materi yang telah saudara bahas

Jawab :

Kloning adalah perbanyakan sel atau organisme secara aseksual. Hasil kloning adalah klon, yakni
populasi yang berasal dari satu sel atau organisme yang mempunyai rangkaian kromosom yang
sama dan sifat yang identik dengan induk asalnya. Proses perbanyakan salinan DNA interest disebut
dengan kloning gen. Kloning gen dilakukan untuk menyalin suatu gen untuk mendapatkan sifat
unggul tertentu dari suatu spesies. Syarat-syarat kloning gen yaitu DNA yang terdiri dari 2 atau
lebih (DNA rekombinan), sumber DNA, adanya vektor, enzim endonuklease restriksi, enzim ligase,
dan adanya sel inang. Tahapan-tahapan dalam mengkloning suatu gen yaitu isolasi fragmen DNA,
penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor, introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang, dan
seleksi hasil kloning.
REFERENSI
http://eprints.walisongo.ac.id/3721/4/102111056_Bab3.pdf
https://www.google.com/amp/s/slideplayer.info/amp/3658789/ https://www.google.com/url?
sa=t&source=web&rct=j&url=http://repo.unand.ac.id/4623/ 2/Kloning%2520Kandidat
%2520Fragmen%2520DNA%2520Bermotif%2520Mikrosateli t%2520Penanda
%2520Genet18052017113051.pdf&ved=2ahUKEwih4OvTqufvAhU6zT
gGHQI2B0YQFjADegQIHxAC&usg=AOvVaw3oSUC2HeyYV6uiU3JTi-
Hd&cshid=1617634560471