Mengklon Gen Membuka Bidang Baru Dalam Kesehatan

Kelompok 10
1. Alfi Chaira
(1701011465)

2. Asti Eliani Srg

(1701011344)

3. Dinda Indah Lazuardi

(1701011187)

4. Rahmi Putri Wardati

(1701011410)
 Asti
pendahuluan

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama
lain dengan ikatan peptida.
Gen merupakan bagian-bagian dari urutan asam nukleat yang terdapat pada DNA.
Gen adalah sepotong DNA yang menyandikan rantai polipeptida dan RNA. Semua sifat
yang dimiliki oleh organisme ditentukan oleh gen-gen yang dimilikinya.
Peran sentral dalam kehidupan sel dimainkan oleh protein (polipeptida) dan DNA (gen).
 Asti
pendahuluan

Obat-obatan yang diproduksi secara bioteknologi adalah protein. Protein terapeutik seperti antibodi
monoklonal, protein darah, dan enzim yang diproduksi oleh organisme hidup untuk melawan penyakit dapat
dianggap sebagai obat bioteknologi. Obat ini tidak diproduksi secara sintetis (misalnya disintesis secara
kimia dengan menambahkan satu senyawa pada suatu waktu) tetapi biasanya diproduksi melalui fermentasi
mikroba atau oleh kultur sel mamalia.

Bioteknologi adalah sebagai pengaplikasian dari prinsip - prinsip ilmiah dan rekayasa untuk pengolahan
bahan oleh agen biologi (mikroorganisme) untuk menyediakan suatu produk baik barang maupun jasa yang
berguna untuk kehidupan manusia. Bioteknologi pada farmasi menghasilkan produk seperti Hormon,
interferon, antibiotik, dan antibodi monoklonal. Pada pembuatannya melibatkan teknik rekayasa genetik
dengan memanipulasi gen yang dibantu oleh mikroorganisme.
 Asti
pendahuluan
Rekayasa genetika adalah suatu bioteknologi yang bisa meliputi manipulasi gen,
kloning gen, DNA rekombinan, teknologi modifikasi genetik, dan genetika modern
dengan menggunakan berbagai macam prosedur.

Rekombinasi DNA

2
Klasifikasi
jenis Fusi Sel (teknologi hibridoma)
rekayasa
genetika
3

Transfer inti (Kloning)

 Asti
Kloning

Kloning adalah suatu upaya tindakan untuk memproduksi atau menggandakan sejumlah
individu yang hasilnya secara genetic sama persis (identik) berasal dari induk yang sama,
mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama.

Sekelompok sel yang identik

Klon sel 1 sifat-sifat genetiknya, semua
berasal dari satu sel.

Klon umumnya digunakan

pada 2 pengertian diantaranya
adalah :
Sekelompok salinan gen yang
Klon gen bersifat identik yang direplikasi
2 dari satu gen yang dimasukan
dalam sel inang.

Jenis - jenis kloning
Artificial Embryo
Twinning
Cara ini yang mencontohi proses
alamiah terjadinya kembar identik.
Pada embrio yang masih dini
dilakukan separasi secara manual
sehingga menghasilkan sel-sel
individu, yang selanjutnya akan
membelah dan berkembang. Embrio
ini diimplantasikan pada inang
subtitusi sampai cukup bulan dan
kemudian dilahirkan. Oleh karena
embrio-embrio klon ini berasal dari
zigot yang sama maka mereka secara
genetik identik.
Asti
Somatic cell nuclear Kloning gen (DNA
transfer (SCNT) Rekombinan)
Cara ini memberi hasil yaitu salinan Kloning ini merupakan pemindahan
genetik yang sama. Sel somatik yang sebagian rantai DNA yang diinginkan
dipakai adalah sel-sel di dalam tubuh. dari suatu organisme pada satu
Pada mamalia setiap sel somatik elemen replikasi genetic. Salah satu
mempunyai dua set kromosom yang contohnya adalah penyisipan DNA
lengkap. Inti sel somatik ditransfer ke dalam plasmid bakteri untuk
sel telur yang telah dilakukan mengklon satu gen.
enukleasi. Sel telur dengan inti baru
ini akan berlaku sebagai zigot, yang
kemudian diimplantasikan ke inang
subtitusi. SCNT bertujuan utama
untuk menghasilkan embrio.
 Asti
Kloning Gen (DNA rekombinan)

Produksi salinan persis dari gen atau urutan DNA tertentu menggunakan teknik rekayasa genetika
disebut kloning gen.

Istilah "kloning gen", "kloning DNA", "kloning molekuler", dan "teknologi DNA rekombinan"
semuanya mengacu pada teknik yang sama.

Ketika DNA diekstraksi dari suatu organisme, semua gennya diperoleh. Dalam gen (DNA) kloning gen
tertentu disalin membentuk "klon".

Kloning merupakan salah satu metode yang digunakan untuk isolasi dan amplifikasi gen yang
diinginkan.
 Alfi

DNA
kromosom

cDNA
(complementary
Sumber DNA untuk di klon DNA) yang disintesis
dari mRNA sebagai
cetakan (template)

DNA yang
dihasilkan dari
perbanyakan PCR
 Alfi

Kloning DNA
dapat dilakukan
dengan dua
metode berbeda:

Kloning DNA Kloning DNA

berbasis sel tanpa sel (PCR)
 Kloning DNA Berbasis Sel Alfi

Fragmen DNA, yang

mengandung gen yang
diinginkan untuk dikloning

Enzim restriksi dan enzim
ligase 
Persyaratan
Kloning Gen
(Berbasis Sel)

Vektor - untuk membawa,

memelihara dan mereplikasi
gen kloning dalam sel inang

Sel inang - di mana DNA

rekombinan dapat bereplikasi
 Alfi
Prinsip

Fragmen DNA, yang mengandung gen yang akan diklon, dimasukkan ke

dalam vektor yang sesuai, untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan. Vektor bertindak sebagai kendaraan yang mengangkut gen ke
dalam sel inang biasanya bakteri. Di dalam sel inang vektor berkembang
biak, menghasilkan banyak salinan identik. Ketika sel inang membelah,
salinan molekul DNA rekombinan diteruskan ke keturunannya dan replikasi
vektor lebih lanjut terjadi. Setelah sejumlah besar pembelahan sel, koloni,
atau klon, sel inang identik diproduksi. Setiap sel dalam klon berisi satu atau
lebih salinan molekul DNA rekombinan (gen yang dibawa oleh molekul
rekombinan sekarang dikatakan sebagai kloning).
 Alfi
Langkah-Langkah Dasar dalam Kloning Gen

Pemilihan sel inang yang ditransformasikan dan

Isolasi fragmen DNA [gen yang menarik] 1 4 identifikasi klon yang mengandung gen yang
untuk dikloning.
diinginkan.

Penyisipan DNA hasil isolasi ke dalam vektor

yang sesuai untuk membentuk DNA 2 5 Perkalian / Ekspresi Gen yang diperkenalkan di
host.
rekombinan.

Pengenalan DNA rekombinan ke dalam Isolasi beberapa salinan gen dan pemurnian
organisme cocok yang dikenal sebagai inang.
3 6 salinan
Alfi
 Cara Mengidentifikasi Klon Alfi

Identifikasi klon bertujuan untuk membedakan/ menyeleksi hanya plasmid yang membawa DNA rekombinan.
Identifikasi klon dilakukan dengan cara Replica Plating dan dilanjutkan dengan Hibridisasi Koloni yang bertujuan
untuk membedakan DNA gen target dengan yang bukan, karena diantara DNA rekombinan tidak semua membawa DNA
gen target

1. Replica Plating

Bakteri ditumbuhkan pada

Bakteri yang tumbuh dipindahkan pada 1
media agar yang diberi
media agar yang diberi antibiotic tetrasiklin. antibiotik ampicillin
2

Koloni yang mengandung DNA rekombinan Apabila koloni tidak tumbuh,

3
kemudian di buat Master Plate media dengan maka mengandung DNA
X-gal. koloni yang berwarna biru memiliki rekombinan.
gen lacZ fungsional, sedangkan koloni
4
berwarna putih memiliki gen lacZ tidak
fungsional.
 Dinda

2. Hibridisasi koloni

1
Diatas media master plate diletakkan
membrane nitroselulose yang
kemudian akan terjadi difusi larutan 2
agar ke membrane sehingga bakteri
tumbuh pada membrane DNA bakteri pada membrane kemudian
dicuci dengan beberapa proses, dan
dilanjutkan dengan denaturasi sehingga 3
menjadi utas tunggal Dilakukan hibridisasi DNA
bakteri dengan probe (pelacak)
yang telah terlabel, maka DNA
yang terhibridisasi merupakan
DNA rekombinan gen target.
Dinda
 Kloning DNA Tanpa Sel (PCR) Dinda

PCR adalah metode penyalinan molekul DNA. Tujuan reaksi PCR biasanya untuk
mereplikasi hanya sebagian dari genom yang diinginkan. Karena PCR hanya
menghasilkan miliaran salinan DNA yang diinginkan, proses ini dikenal sebagai
"amplifikasi".

Yang dibutuhkan untuk kloning DNA tanpa sel (PCR) :

Sequence
information
Oligonucleotide DNA
primers nucleotide

Heat-Stable DNA Taq (thermos

Polymerase aquaticus)
 Dinda
Ada tiga tahap utama:

Denaturasi
Ketika DNA template untai ganda dipanaskan
untuk memisahkannya menjadi dua untai
tunggal.

Annealling
Saat suhu diturunkan untuk memungkinkan
primer DNA menempel pada DNA cetakan.

Extending
Ketika suhu dinaikkan dan untaian DNA baru
dibuat oleh enzim polimerase Taq.
 Dinda
Aplikasi Kloning
Kloning gen telah membuat dampak yang fenomenal pada kecepatan penelitian biologi dan meningkatkan
keberadaannya di beberapa bidang kehidupan sehari-hari. Salah satu alasan mengapa bioteknologi mendapat begitu
banyak perhatian adalah karena kloning gen.

 Produksi protein rekombinan

 Rekombinasi protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan dalam berbagai cara untuk
menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen dan memproduksi produk komersial yang
bermanfaat.
 Protein rekombinan merupakan protein yang diperoleh dari hasil teknologi DNA rekombinan
 Melalui teknologi DNA rekombinan dapat dilakukan pemindahan gen pengode enzim/protein dari satu
organisme ke organisme lain
 Protein rekombinan membutuhkan jenis vektor kloning khusus
Langkah Dasar Mendapatkan Protein Rekombinan: Dinda

Amplifikasi gen yang

1 diinginkan

Masukkan ke dalam
kloning vektor 2

Sub kloning kedalam

3 vektor ekspresi.

Transformasikan kedalam sel inang ekspresi

protein (bacteria (E coli), yeast, mammalian 4
cells or baculovirus-insect cell system).
Tes untuk identifikasi protein rekombinan.
5 (Western blot or Fluorescence)

Produksi skala besar. (fermentasi skala besar)

6

Isolasi dan purifikasi

7
Dinda
 Rahmi
Ekspresi protein rekombinan
Ekspresi protein rekombinan adalah pembuatan protein yang berasal dari DNA rekombinan. Banyak hormone
dan enzim secara historis berasal dari sumber hewani sekarang disintesis oleh ekspresi protein rekombinan, kemudian
dipanen dan dimurnikan dari sel inang.
Untuk mengekspresikan protein, dipilih sel yang akan digunakan sebagai sumber protein. Mikroorganisme,
jamur, sel tumbuhan, dan sel hewan memiliki kualitas unik yang menjadikan pilihan yang baik dalam keadaan yang
tepat.

Ekspresi protein rekombinan pada bakteri

Beberapa metode teknologi DNA rekombinan apat digunakan untuk meningkatkan tingkat produksi protein
bakteri. Spesies bakteri yang paling umum digunakan untuk menghasilkan rekayasa genetika adalah E.coli. Dalam
beberapa kasus, gen asing (dalam bentuk cDNA) untuk produk protein yang diinginkan melekat langsung ke gen
E.coli. E.coli hasil rekayasa genetika menghasilkan protein yang diinginkan dalam bentuk protein fusi.
Mayoritas protein yang disintesis secara alami oleh E.coli bersifat intraseluler (di dalam sel). Protein asing yang
dihasilkan terakumulasi dalam sitoplasma sel dalam bentuk rumpun yang tidak dapat larut yang disebut badan inklusi,
yang seharusnya dimurnikan dari protein sel sebelum digunakan.
 Rahmi
APLIKASI

Berikut ini adalah daftar protein penting yang dihasilkan dari DNA rekombinan , menggunakan rekayasa

biomolekuler. Sejumlah besar protein rekombinan digunakan di laboratorium penelitian. Ini termasuk protein yang
tersedia secara komersial (misalnya sebagian besar enzim yang digunakan di laboratorium biologi molekuler), dan
yang dihasilkan dalam proyek penelitian khusus.

Bidang kesehatan Bidang industri Bidang pertanian &

• Produksi vaksin Produksi enzim : peternakan
• Produksi insulin • Amilase • Kultur sel
• Antibodi monoclonal • Protease • Produksi embrio
• Interferon • Lipase • Produk-produk
• eritropoetin transgenik
 Rahmi
Review Jurnal

Kloning Gen Penyandi Antigen HBsAg 100 dalam Rangka Produksi Protein Rekombinan Sebagai Model
Imunogen untuk Menghasilkan Antibodi

Jurnal ini di latarbelakangi karena pada tahun 1987, Pulau Lombok ditetapkan sebagai model imunisasi
masal hepatitis B pertama di dunia oleh WHO. Hasil imunisasi dinyatakan belum optimal karena hanya mampu
menurunkan prevalensi hepatitis B sampai 70%. Sehingga perkembangan teknologi molekuler dibutuhkan untuk
memudahkan dihasilkannya berbagai sub unit vaksin yang jauh lebih efektif dari pada vaksin konvensional
dengan dilakukan penelitian rekayasa terhadap gen penyandi antigen permukaan hepatitis B untuk menghasilkan
antigen HBsAg pada E. coli dengan menggunakan teknologi rekombinan.

Metode :
Amplifikasi fragmen S penyandi antigen permukaan virus hepatitis B, digunakan plasmid pGET-HB dan enzim
DNA polimerase yang digunakan adalah enzim pyrobest . Fragmen diligasi menggunakan vektor pGEX-4T-2 .
Plasmid rekombinan ditransformasi ke bakteri E. coli DH5a. Kultur bakteri dilakukan pada media Luria Bertani.
Isolasi plasmid untuk sekuensing digunakan Kit Nucleospin.
 Rahmi
1. Pertama kali dilakukan yaitu amplifikasi gen penyandi HBsAg100 menggunakan teknik PCR (denaturasi –
annealing – ekstensi) menggunakan enzim polymerase pyrobest dan plasmid pGEMT-HB sebagai cetakan,
hasil sampel yang sudah dielektroforesis dimurnikan dengan DNA gel extraction kit dan diligasi dengan
plasmid pGEX-4T-2 dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 12oC selama 18 jam.

2. Setelah itu, DNA rekombinan ditransformasi pada E. coli DH5a untuk kemudian ditumbuhkan pada media
LB yang mengandung ampicilin pada suhu 37oC selama 14 jam.

3. Selanjutnya dilakukan skrining terhadap koloni E. coli DH5a yang membawa plasmid rekombinan
dilakukan dengan PCR koloni.

4. Skrining yang dilakukan yaitu dibuat replika dari koloni bakteri yang di skrining pada media LB yang
mengandung ampicilin dan ditumbuhkan pada suhu 37 oC dengan teknik PCR. Kemudian sampel diangkat
untuk dielektroforesis. Adanya pita DNA dari gambar hasil elektroforesis merupakan indikasi
bahwa klon yang diamplifikasi mengandung plasmid rekombinan.

5. Koloni yang mengandung plasmid rekombinan pada replika kemudian dikultur pada media LB untuk isolasi
plasmid rekombinan.

6. Selanjutnya sekuensing DNA dengan Kit BigDye dengan menggunakan primer pGEX-5’ agar gen target
tidak terdapat mutasi.
 Rahmi
Hasil dan Pembahasan :
Ketepatan suhu dan waktu annealing, konsentrasi DNA dan primer, serta konsentrasi enzim polymerase DNA yang
digunakan sangat menentukan keberhasilan amplifikasi untuk hasil optimal. Hasil produk PCR dimurnikan dan hasil
pemurnian tersebut digunakan pada tahap ligasi dengan plasmid pGEX-4T-2. selanjutnya introduksi plasmid pGEX-
HB100 ke dalam bakteri inang E. coli DH5a (transformasi) dilakukan dengan teknik heat shock dan berhasil.

Koloni bakteri E. coli DH5a pembawa plasmid rekombinan pGEX- HB100 hasil transformasi ditumbuhkan pada
media seleksi (ampisilin 50 µl/ml) yang mengandung X-gal dan IPTG. Hasil kultur dari Koloni bakteri yang
berwarna putih diduga membawa plasmid rekombinan pGEX-HB100, sedangkan koloni bakteri yang berwarna biru
tidak membawa plasmid.

Untuk memastikan bahwa bakteri - bakteri berwarna putih pembawa gen HB100, maka dilakukan skrining dengan
PCR menggunakan koloni bakteri tersebut sebagai cetakan (PCR Koloni). Selanjutnya Koloni yang mengandung
plasmid rekombinan dengan hasil PCR koloni pita tunggal kemudian dikultur dari replika pada media LB untuk
isolasi plasmid rekombinan. Plasmid hasil isolasi tersebut kemudian disekuensing.

Hasil sekuensing nukleotida disejajarkan dengan sekuen asli virus hepatitis B. Hasil pensejajaran (aligment)
sekuensing plasmid rekombinan yang diisolasi dari koloni bakteri rekombinan menunjukkan kesamaan dengan
sekuen dari bagian genom virus hepatitis B. Hal ini menunjukkan bahwa gen hasil amplifikasi tersebut tidak
mengalami mutasi dan dapat digunakan untuk menghasilkan antigen hepatitis B bagian S pada bakteri. Plasmid
rekombinan yang tidak memiliki mutasi pada sekuen insertnya selanjutnya disimpan untuk ditransformasikan pada
E. coli BL21 untuk memproduksi protein HBsAg100
 Rahmi

Kesimpulan :
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gen penyandi antigen HBsAg100 berhasil diamplifikasi,
kemudian diligasi dengan vektor pGEX-4T-2, dan ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli
DH5a. Hasil sekuensing menunjukkan tidak terdapat mutasi pada gen hasil kloning. Oleh karena itu, penelitian
lanjutan yang harus dilakukan adalah uji ekspresi untuk menghasilkan protein rekombinan sebagai kandidat vaksin.

196829-ID-kloning-gen-penyandi-antigen-hbsag100-da.pdf
TERIMAKASIH