SCRENNING DAN SELEKSI UNTUK DNA

REKOMBINAN
• Seni kloning adalah untuk menemukan satu sel
berubah tertentu yang berisi vektor kloning
dengan gen yang diinginkan (disebut sebagai sel
rekombinan). Hal demikian yang paling penting
untuk dapatpilih sel rekombinan dari sel-sel
berubah(Mengandung vektor tanpa DNA insert).
Jika tujuan ini telah dicapai gen tersebut
dikatakan telah diklon.
• Meskipun ada banyak prosedur yang berbeda
dimana klon yang diinginkan dapat diperoleh,
semua variasi dua konsep dasar:
• • pemilihan langsung, Yang berarti bahwa percobaan
kloning dirancang sedemikian rupa bahwa klon
diperoleh adalah klon mengandung gen yang
diperlukan. Hampir selalu, seleksi terjadi pada tahap
plating-out. pemilihan langsung adalah metode
pilihan, karena cepat dan biasanya tidak ambigu.
Namun, hal ini tidak berlaku untuk semua gen.
• • Identifikasi clone dari perpustakaan gen, Yang
memerlukan sebuah “shotgun” kloning percobaan
awal, untuk menghasilkan sebuah perpustakaan klon
yang mewakili seluruh atau sebagian besar gen hadir
dalam sel, diikuti dengan analisis dari klon individu
untuk mengidentifikasi yang benar.
• pemilihan langsung:
• Kebanyakan vektor kloning dirancang sehingga
penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
menghancurkan integritas salah satu gen
hadir pada molekul. Hal ini disebut sebagai
inaktivasi insersional . Dua contoh akan
dibahas: (I) Langsung skrining resistensi
antibiotik, dan (II) biru-putih warna Screnning.
skrining resistensi antibiotik langsung

• Kebanyakan vektor kloning yang dirancang sehingga

penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor menghancurkan
integritas salah satu gen hadir pada molekul (biasanya gen
resistensi antibiotik). Misalnya, jika vektor membawa gen
resistensi ampisilin (AMPR), Itu akan memberikan resistensi
ampisilin ke E. coli sel jika proses transformasi berhasil. Ini
berarti bahwa ketika klon yang berlapis pada media
ampisilin mengandung, hanya sel yang mengandung
plasmid akan menjadi resisten terhadap antibiotik dan,
oleh karena itu, dapat tumbuh. Namun, ini tidak
menunjukkan apakah sel mengandung plasmid rekombinan
(dengan gen yang disisipkan bunga) atau hanya vektor re-
diligasi (tanpa gen yang disisipkan bunga).
 Biru-putih warna screnning

• Metode ini juga melibatkan inaktivasi insersional

gen dan menggunakan produksi senyawa biru
sebagai indikator. Gen adalahlacZ, Yang
mengkode enzim ß-galaktosidase, dan berada di
bawah kendali lac promotor. Jika tuan rumahE.
coli regangan mengungkapkan represor lac,
ekspresi lacZ gen pada vektor dapat dirangsang
menggunakan IPTG (isopropyl- ß-D-
thiogalactopyranoside), Dan enzim menyatakan
dapat memanfaatkan substrat sintetis X-gal (5-
bromo-4-chlore-3-indolyl- ß-D-galactopyranoside)
Untuk menghasilkan produk biru.
• Penyisipan fragmen DNA ke dalam lacZ gen (inaktivasi
insersional dari lacZ) Dalam produksi plasmid
rekombinan akan mencegah perkembangan biru
warna. Dalam metode ini, sel-sel berubah tersebar ke
piring yang mengandung antibiotik (untuk memilih
untuktransformandengan cara yang biasa), IPTG dan X-
gal, untuk menghasilkan campuran koloni biru dan
putih. Koloni putih tidak diungkapkan ß-galaktosidase
dan karenanya cenderungmengandung sasaran
fragmen dimasukkan. Koloni biru mungkin
mengandungreligated vektor.
 Identifikasi klon dari sebuah
perpustakaan gen:
• Banyak teknik yang berbeda yang tersedia untuk
skrining perpustakaan. Pendekatan yang paling penting
melibatkan skrining dengan hibridisasi asam nukleat
dan penyaringan dengan analisis fungsional. Hibridisasi
asam nukleat memerlukan beberapa pengetahuan
sebelumnya dari urutan DNA salah satu dari gen yang
akan dikloning atau peregangan DNA di sekitar gen
yang akan dikloning.screening fungsional melibatkan
penggunaan vektor ekspresi yang memungkinkan sel-
sel yang mengandung vektor dengan gen yang
diinginkan untuk mengekspresikan protein yang
sesuai. Dalam keadaan ini, sel-sel yang mengandung
vektor dengan gen yang diinginkan dapat diidentifikasi
dengan caraantibodi diarahkan terhadap protein.
 hibridisasi asam nukleat

• Deteksi klon individu dalam perpustakaan dapat dicapai

dengan menggunakan strategi hibridisasi asam nukleat
yang singkat kimia disintesis oligonukleotida berlabel
(probe) Digunakan untuk mendeteksi urutan
komplementer dalam sel individu atau fag yang
mengandung insert. Keberhasilan koloni atau plak
hibridisasi akan tergantung pada ketersediaan molekul DNA
yang dapat digunakan sebagai probe.Probe ini harus
berbagi setidaknya bagian dari urutan gen kloning. Jika
gen itu sendiri tidak tersedia, dapat diturunkan, misalnya,
dari urutan protein yang dikenal, atau disebut
oligonukleotida merosot (campuran dari oligonukleotida
yang berbeda satu sama lain dengan substitusi dasar di dan
/ atau posisi yang berbeda identik) dapat digunakan .
• Langkah pertama dari percobaan skrining hibridisasi
melibatkan transfer DNA dalam plak atau koloni ke
membran nilon atau nitroselulosa. Bakteri pada
membran yang segaris untuk melepaskan DNA mereka,
dan DNA didenaturasi dengan alkali untuk
menghasilkan untaian tunggal yang dibatasi dengan
membran dengan perlakuan panas atau radiasi UV.
membran tersebut kemudian direndam dalam larutan
yang mengandung probe asam nukleat (biasanya
berlabel radioaktif) dan diinkubasi untuk
memungkinkan probe untuk berhibridisasi dengan
urutan komplementer. Setelah hibridisasi, membran
dicuci untuk menghilangkanunhybridized menyelidiki,
dan daerah di mana probe telah hibridisasi yang
divisualisasikan dengan autoradiografi.
 skrining fungsional

• gen yang diinginkan juga dapat diidentifikasi dengan

kegiatan produk gen dikodekan. Dalam hal ini, satu
menggunakan apa yang disebut ekspresi perpustakaan
yang telah ditetapkan oleh kloning DNA (cDNA dalam
kasus eukariota) fragmen ke dalam vektor kloning
khusus yang memungkinkan ekspresi fungsional
fragmen DNA kloning. produk gen fungsional dan
karenanya klon yang diinginkan kemudian dapat
dideteksi baik oleh antibodi (screening imunologi) atau
yang lain ligan yang secara khusus mengenali protein
yang dikodekan atau dengan memanfaatkan
bioaktivitas dari produk gen, jika diketahui.
• Prosedur skrining imunologi memiliki
kesamaan dengan skrining hibridisasi,
dibahas sebelumnya, meskipun dalam hal ini
adalah protein yang dikode oleh DNA (atau
cDNA) daripada DNA sendiri yang terdeteksi
pada membran. membran diperlakukan
kovalen melekat protein, dan direndam
dalam larutan yang mengandung antibodi.
Ketika antibodi telah terikat epitop, itu
terdeteksi oleh antibodi lain dan / atau
bahan kimia yang mengenalinya.
 kromosom berjalan
• kromosom berjalan
• Seringkali, klon
genom mungkin
tidak mencakup
semua dari urutan
untuk gen tertentu
sehingga perlu
untuk mengisolasi
tumpang tindih klon
yang mencakup
wilayah genomik
bunga. Proses ini
dikenal sebagai
kromosom berjalan.