RESUME BIOTEKNOLOGI KLONING DNA DAN TRANSFORMASI PLASMID REKOMBINAN PADA SEL KOMPETEN

ANGGOTA KELOMPOK: HADAINA ZULFAH SIN SYIN LULU HANDAYANI SOLIKHAH K4311031 K4311067 K4311071

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2013

A. KLONING DNA Kloning adalah suatu upaya untuk memproduksi sejumlah individu yang secara genetic sama persis (identik) (Alberts et al., 1994). Sedangkan istilah klon adalah sekelompok organisme hewan maupun tumbuh-tumbuhan yang dihasilkan melalui reproduksi aseksual dan berasal dari satu induk yang sama. Setiap anggota dari klon tersebut mempunyai susunan dan jumlah gen yang sama dan kemungkinan besar fenotipnya juga sama. Cloning didasarkan pada prinsip bahwa setiap makhluk hidup mempunyai kemampuan totipotensi yang artinya setiap sel mempunyai kemampuan untuk menjadi individu. Kloning adalah tindakan menggandakan atau mendapatkan keturunan tanpa fertilisasi, berasal dari induk yang sama, mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan kemungkinan besar mempunyai fenotip yang sama. 1. Kloning DNA Rekombinan Kloning DNA adalah memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu sel bakteri. DNA yang dimasukkan ini akan bereplikasi (memperbanyak diri) dan diturunkan pada sel anak pada waktu sel tersebut membelah. Gen asing ini tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada dalam sel bakteri. Pembentukan DNA rekombinan ini disebut juga rekayasa genetika. Perekayasaan genetika terhadap satu sel dapat dilakukan dengan hanya menghilangkan, menyisipkan atau menularkan satu atau beberapa pasang basa nukleotida penyusun molekul DNA tersebut. Untuk kloning ini diperlukan plasmid dan enzim untuk memotong DNA, serta enzim untuk menyambungkan gen yang disisipkan itu ke plasmid. Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing atau DNA yang diinginkan atau DNA sasaran harus memenuhi hal-hal sebagai berikut. DNA plasmid vektor harus dimurnikan dan dipotong dengan enzim yang sesuai sehingga terbuka. DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk membentuk rekombinan buatan harus dipotong dengan enzim yang sama. Reaksi pemotongan dan penggabungan

harus dipantau dengan menggunakan elektroforesis gel. Rekombinan buatan harus ditransformasikan ke E. coli atau ke vektor lainnya. Rekayasa genetik dengan menggunakan plasmid bakteri E. coli dapat dilakukan sebagai berikut. Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen pengkode hormone insulin dari sel-sel pankreas manusia atau gen pengkode hormone pertumbuhan dari kelenjar pituitari. Kromosom sel-sel pankreas dikeluarkan dengan memecah membran plasma. Membran plasma ini dipecah dengan diberi kejutan listrik atau dengan pemberian zat kimia yaitu polietilen glikol atau kalsium klorida (CaCl2), sehingga kromosom dapat keluar dari sel pankreas. Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease untuk melepaskan bagian DNA yang diinginkan, kemudian memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk persiapan memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan untuk menganalisis. Mengektraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan cara memecah dinding sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan deterjen atau dengan enzim lisozim, kemudian dilisis dengan natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA kromosom akan menggumpal dan dinetralisir dengan natrium asetat. DNA plasmid ini akan menggumpal membentuk jaring-jaring dan dengan mudah mengendap. Untuk memisahkan DNA ini dilakukan sentrifugasi. Cairan yang mengandung plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan etanol. DNA plasmid yang dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid yang berbentuk lingkaran itu dipotong dengan enzim restriksi endonuklease yaitu enzim yang sama digunakan untuk memotong DNA pankreas. Enzim ini memecah ikatan fosfodiester pada molekul DNA. Endonuklease memecah asam nukleat pada posisi internal, sedangkan enzim eksonuklase memecah molekul DNA dari ujung molekulnya. Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam plasmid dengan menggunakan enzim ligase yang fungsinya menggabungkan ikatan

fosfodiester

antara

fragmen

ujung-ujung

yang

terpotong

tadi.

Proses

penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim yang digunakan untuk memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama jenisnya, akan menghasilkan ujung-ujung yang lengket yang sama strukturnya, sehingga penyambungannya akan menyatu sempurna. Suhu optimum untuk ligasi adalah 37oC, tetapi ikatannya tidak stabil. Ligasi akan berhasil jika dilakukan pada suhu 4o-150oC. Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan ke dalam sel bakteri coli dengan cara tranformasi. Transformasi dilakukan dengan memasukkan bakteri E. coli ke dalam larutan CaCl2 sehingga terbentuk lubanglubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam sel bakteri. Diharapkan bakteri yang telah disisipi gen tersebut mewarisi sifat gen baru, sehingga bakteri yang telah disisipi dengan gen pengkode insulin dapatm memproduksi insulin. Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan bakteri hasil rekayasa dalam tabung fermentasi yang berisi medium untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi insulin dalam jumlah yang banyak. Insulin yang terbentuk kemudian dipisahkan dari senyawa yang lain. (http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompetenmetode-cacl2/) 2. Manfaat Kloning Secara garis besar kloning bermanfaat: Untuk pengembangan ilmu pengetahuan Manfaat kloning terutama dalam rangka pengembangan biologi, khususnya reproduksi-embriologi dan diferensiasi. Dengan pengembangan ilmu pengetahuan baru di bidang bioteknologi akan membuka peluang lebar bagi peneliti untuk menemukan cara baru lagi untuk memecahkan masalah-masalah yangberujung pada peningkatan kesejahteraan masyarakat. Untuk mengembangkan dan memperbanyak bibit unggul Seperti telah kita ketahui, pada sapi telah dilakukan embrio transfer. Hal yang serupa tentu saja dapat juga dilakukan pada hewan ternak lain, seperti pada domba, kambing dan lain-lain. Dalam hal ini jika nukleus sel donornya diambil dari bibit unggul, maka anggota klonnya pun akan mempunyai sifat-sifat

unggul tersebut. Sifat unggul tersebut dapat lebih meningkat lagi, jika dikombinasikan dengan teknik transgenik. Dalam hal ini ke dalam nukleus zigot dimasukkan gen yang dikehendaki, sehingga anggota klonnya akan mempunyai gen tambahan yang lebih unggul. Untuk tujuan diagnostik dan terapi Sebagai contoh jika sepasang suami isteri diduga akan menurunkan penyakit genetika thalasemia mayor. Dahulu pasangan tersebut dianjurkan untuk tidak mempunyai anak. Sekarang mereka dapat dianjurkan menjalani terapi gen dengan terlebih dahulu dibuat klon pada tingkat blastomer. Jika ternyata salah satu klon blastomer tersebut mengandung kelainan gen yang menjurus ke thalasemia mayor, maka dianjurkan untuk melakukan terapi gen pada blastomer yang lain, sebelum dikembangkan menjadi blastosit. Menolong atau menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan Manfaat yang tidak kalah penting adalah bahwa kloning manusia dapat membantu/menyembuhkan pasangan infertil mempunyai turunan. Secara medis infertilitas dapat digolongkan sebagai penyakit, sedangkan secara psikologis ia merupakan kondisis yang menghancurkan, atau membuat frustasi. Salah satu bantuan ialah menggunakan teknik fertilisasi in vitro. (in vitro fertilization = IVF). Namun IVF tidak dapat menolong semua pasangan infertil. Misalnya bagi seorang ibu yang tidak dapat memproduksi sel telur atau seorang pria yang tidak dapat menghasilkan sperma, IVF tidak akan membantu. Dalam hubungan ini, maka teknik kloning merupakan hal yang revolusioner sebagai pengobatan infertilitas, karena penderita tidak perlu menghasilkan sperma atau telur. Mereka hanya memerlukan sejumlah sel somatik dari manapun diambil, sudah memungkinkan mereka punya turunan yang mengandung gen dari suami atau istrinya. Melestarikan Spesies Langka Meskipun upaya terbaik dari konservasionis di seluruh dunia, beberapa spesies yang hampir punah. Kloning Dolly sukses merupakan langkah pertama dalam melindungi satwa langka. Contoh lainnya adalah hasil cloning yang melahirkan Noah, hewan gaur (spesies dari Asia Tenggara yang mirip bison), yang merepresentasikan percobaan pertama yang dilakukan oleh para ilmuwan untuk mengkloning hewan yang terancam punah. Para ilmuwan di Amerika

berharap bisa mengambil langkah besar dalam upaya melindungi spesies yang terancam punah dengan melahirkan kloningan gaur di sebuah peternakan di Iowa. Meningkatkan pasokan makanan Kloning dapat menyediakan sarana budidaya tanaman yang lebih kuat dan lebih tahan terhadap penyakit, sambil menghasilkan produk lebih. Hal yang sama bisa terjadi pada ternak serta di mana penyakit seperti penyakit kaki dan ulut bisa menjadi eradicated. Kloning karena itu bisa secara efektif memecahkan masalah pangan dunia dan meminimalkan atau mungkin kelaparan (Brookes, 2005) 3. Efek Negatif Kloning Jika kloning pada tanaman bertujuan menghasilkan tanaman baru yang memiliki sifat-sifat identik dengan induknya maka kloning pada tanaman akan menghasilkan individu baru yang sama dengan sifat induknya. Hal ini hal ini akan menurunkan keanekaragaman tanaman baru yang dihasilkan. Akibatnya, keanekaragaman tumbuhan yang merupakan sumber daya alam hayati pun akan semakin menurun. Demikian juga kloning pada hewan, akan menurunkan keanekaragaman hewan. Keanekaragaman genetik memainkan peran yang sangat penting dalam sintasan dan adaptabilitas suatu spesies, karena ketika lingkungan suatu spesies berubah, variasi gen yang kecil diperlukan agar spesies dapat bertahan hidup dan beradaptasi. Spesies yang memiliki derajat keanekaragaman genetik yang tinggi pada populasinya akan memiliki lebih banyak variasi alel yang dapat diseleksi. Seleksi yang memiliki sangat sedikit variasi cendering memiliki risiko lebih besar. Dengan sedikitnya variasi gen dalam spesies, reproduksi yang sehat akan semakin sulit, dan keturunannya akan menghadapi permasalahan yang ditemui Kloning pada hewan dan manusia masih dipertentangkan karena akibat yang ditimbulkan seperti contohnya: resiko kesehatan terhadap individu hasil kloning. Terjadi kekecauan kekerabatan dan identitas diri dari klon maupun induknya. Klon atau individu hasil cloning akan diangggap sebagai kopian dari individu lain yang dianggap sebagai induknya karena memiliki sifat yang sama dengan induknya. Sehinggga terjadi kekacauan apakah status klon tersebut adalah

anak atau merupakan kembaran dari individu aslinya.Transformasi adalah proses pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang dengan vektor yang digunakan berupa plasmid. Plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut. Ekspresi materi genetik asing masuk melalui dinding sel. Pada dasarnya dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda asing termasuk DNA, tapi dalam kondisi tertentu, dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki DNA. Ada lebih dari 1% spesies bakteri mampu melakukan transformasi secara alami. Dimana mereka memproduksi protein-protein tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi dinding sel.

B. TRANSFORMASI PLASMID REKOMBINAN PADA SEL KOMPETEN Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten (istilah untuk bakteri yang siap bertransformasi). Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Kita dapat membuat suatu bakteri menjadi kompeten, misalnya dengan mendinginkannya pada larutan yang mengandung kation divalen seperti Ca2+ untuk membuat dinding sel menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid. Sel juga dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl2) atau rubidium klorida (RbCl). Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel kompeten belum diketahui secara jelas. Penambahan etanol pada pembuatan sel kompeten menurunkan efisiensi transformasi. Hal ini dikarenakan adanya leaching terhadap lipopolisakarida dari dinding sel. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa adsorpsi DNA didukung oleh LPS dinding sel bakteri. Mekanisme yang diajukan adalah pengikatan DNA pada molekul LPS sel kompeten dilanjutkan dengan pemasukan DNA ke sitosol karena adanya disintegrasi membran sel akibat CaCl2 (Sarkar et al. 2002). Menurut Primrose & Twyman (2006), CaCl2 mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas.Selain itu, perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat

dilakukan dengan menggunakan metode kejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik (metode electroporation).

Chemical Transformation (image from biochem.arizona.edu) Selain teknik heat-shock, sejak tahun 1980 telah digunakan teknik elektroforasi yaitu dengan mengejutkan sel bakteri dengan medan listrik berkekuatan tinggi (10-20 kV/cm). Saking terkejutnya, akan terbentuk lubang-lubang pada dinding sel yang bisa diterobos DNA plasmid berukuran besar dan kemudian lubang tersebut akan tertutup dengan sendirinya.

Electrophoretic Transformation (image from biochem.arizona.edu) Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja. 1. Cara Gen Ditransformasi

Umumnya transformasi bertujuan mengekspresikan suatu gen tertentu di dalam sel inang. Agar gen yang berupa fragmen DNA (biasa disebut insert) ini dapat masuk, ia harus dibuat menjadi DNA plasmid dulu dengan menyisipkannya pada suatu DNA vektor. Berikut ini tahapan-tahapan insersi gen ke plasmid/vektor.

Insert Digestion (image from biochem.arizona.edu)

Plasmid (Vector) Digestion (image from biochem.arizona.edu)

Insert-Plasmid Ligation (image from biochem.arizona.edu) 2. Cara memastikan transformasi berhasil Kita tahu bahwa setiap sel termasuk bakteri memiliki sistem pertahanan diri terhadap benda asing termasuk DNA. Jika sel bakteri menemukan adanya DNA asing, maka enzim restriksi sebagai penjaga benteng akan memotong-motong DNA tersebut hingga menjadi pendek dan tak berfungsi lagi. Agar DNA plasmid yang ditransformasi tidak dicincang oleh enzim restriksi, maka ia harus memiliki bagian yang dinamakan ori atau origin of replication yang dikenali oleh bakteri yang bersangkutan. Ori ini berfungsi mengelabui bakteri agar tidak menganggapnya sebagai DNA asing. Ori juga merupakan signal agar bakteri tersebut melakukan replikasi alias penggandaan DNA plasmid secara independen seiring dengan replikasi DNA genomnya. Untuk membedakan antara bakteri yang sudah dimasuki DNA plasmid dengan tidak,cara yang paling umum adalah dengan seleksi antibiotik. Kita tahu umumnya bakteri tidak dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk itu pada DNA plasmid yang kita transformasikan harus ada gen penyandi antibiotik resisten agar bakteri hostnya menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Jadi bakteri yang tidak berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan sendirinya.

Reaksi Ligasi tidak akan 100% berhasil menyambungkan vektor dan insert. Bisa saja terjadi vektor berligasi sendiri (vector self-ligation), atau justru insert yang berligasi sendiri (insert self-ligation). Insert biasanya disisipkan di pertengahan gen lacZ yang merupakan penyandi lacZ- subunit dari enzim -galactosidase, subunit lainnya, yaitu lacZ-w subunit dihasilkan oleh gen yang terdapat pada kromosom bakteri host-nya. Enzim ini dapat memecah substrat seperti X-gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4chloro-3-hydroxyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5-dibromo-4,4dichloro-indigo yang berwarna biru.

Mechanism of X-gal degradation by -galactosidase (image from biochem.arizona.edu) Jika gen LacZ ini masih utuh, maka koloni bakteri akan berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika insert berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi alias rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanya koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal sajalah yang kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan. Inilah yang dinamakan seleksi biruputih.

Insert-Plasmid Ligation (image from biochem.arizona.edu)

DAFTAR PUSTAKA http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metodecacl2/ diakses pada tanggal 1 Oktober 2013

Akberts, B., et al. (1994). Molecular Biology of The Cel. Ed. Ke-3. Garland Publishing, New York

Brookes, Martin. (2005). Genetika. Jakarta : Erlangga

Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. 2000. Molecular Cell Biology fifth Edition. Freeman and Company. New York.

Primrose SB, Twyman RM. 2006. Principles of Gene Manipulation and Genomics. Ed. Ke-7. Oxford: Blackwell Publishing.

Sarkar S, Chaudhuri S, Basu T. 2002. Mechanism of arttificial transformation of E.coli with plasmid DNA-clues from the influence of ethanol. Current Science 83:13761380.

Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science 9:246-252. Tu et al. 2005. An improved system for competent cell preparation and high efficency plasmid transformation using different Escherichia coli strains. Electronic Journal of Biotechnology 8. Williams HG, Day MJ, Fry JC. 1996. Use of EDTA to prevent spontaneous cell-to-cell transformation provides a more accurate estimation of gene transfer frequencies. Biology Techniques 10:941-946. Zhang et al. 2007. Effects of Mg2+ on supported bilayer membrane on a glassy carbon electrode during membrane formation. International Journal of Electrochemical Science 2:788-796.