LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA FISIKA INSTRUMEN DAN

BIOKIMIA

KINETIKA ENZIM

Tanggal Praktikum :14 September 2017

Tanggal pengumpulan :22 September 2017

Disusun oleh :

Putu Chandra Maheswari

10715025

Kelompok: L-2

Nama Asisten : Sarrilya Hareefa (10714065)

LABORATORIUM KIMIA KLINIK

PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2017
I. Tujuan
a. Menentukan nilai Vmax dari dari reaksi enzim GOD PAP dengan
metode enzimatik berdasarkan grafik
b. Menentukan nilai Km dari dari reaksi enzim GOD PAP dengan
metode enzimatik berdasarkan grafik
II. Cara Kerja
Disiapkan 6 tabung reaksi dan diberi label tabung nomor 1 sampai 6

Dipipet enzim GOD-PAP masing –masing dengan konsentrasi 1 ml

Kemudian diinkubasi pada suhu 310 C selama 15 menit

Diukur absorban blanko dengan menggunakan fotometer

Setelah enzim diinkubasi , ditambahkan tabung nomor 1 sampai 6

berurutan dengan konsentrasi 10 µl, 20 µl,30 µl,40 µl,50 µl,60 µl
glukosa menggunakan mikropipet

Selanjutnya ditambahkan dengan air sebanyak 2 mL

Kemudian diaduk higga tercampur dengan baik

Diukur absorban 6 tabung tersebut dengan fotometer , absorban

dihitung saat t=0 menit

Diinkubasi kembali 6 tabung enzim dan substrat selama 5 menit di

dalam inkubator

Dihitung nilai absorban menggunakan fotometer saat t=5 menit

 III. Perhitungan dan Pengolahan Data
Rumus untuk :

Konsentrasi substrat =

v =

Konsentrasi Waktu Inkubasi Absorbansi pada v Konsentrasi

Substrat (menit) 510 nm (kecepatan reaksi) substrat/Absorbans

=0,0033 0 menit 0,064 0,024 0,0515625

5 menit 0,184 0,017934783

=0,0066 0 menit 0,095 0,0142 0,069473684

5 menit 0,166 0,039759036

=0,0099 0 menit 0,099 0,0394 0,1

5 menit 0,296 0,033445946

=0,0131 0 menit 0,088 0,0176 0,148863636

5 menit 0,176 0,074431818

=0,0164 0 menit 0,104 0,0392 0,157692308

5 menit 0,300 0,054666667

=0,0196 0 menit 0,261 0,075 0,075095785

5 menit 0,636 0,03081761

[ ] [ ]
(x) (y)
303,0303 41,6667
151,5152 70,4225
101,0101 25,38071
76,33588 56,81818
60,97561 25,5102
51,02041 13,33333
 Kurva Transormasi Lineweaver -Burk
dari Data Hasil Percobaan
80
1/Vo(menit/absorbansi)

70
60
50
40
30
20
y = 0,0786x + 29,112
10 R² = 0,1186
0
0 50 100 150 200 250 300 350
1/[𝑆] (mL/mg)

[ ]

= =0,03435

a=

KM=

=0,0786 x 0,03435

=2,6999 x 10-3
IV. Pembahasan
Enzim adalah sebuah katalis biologi yang hampir seluruhnya
adalah protein . Fungsi dari enzim adalah untuk mempercepat
terjadinya reaksi kimia terutama di dalam sel dengan cara menurunkan
energi aktivasi tanpa mengubah nilai kesetimbangan . Pada enzim
terdapat sisi aktif yaitu tempat yang akan berikatan dengan substrat.
Enzim ada yang berupa apoenzim dan holoenzim . Apoenzim
adalah enzim dalam keadaan tidak teraktivasi sedngkan holoenzim
adalah enzim dalam keadaan teraktivasi . Proses pengaktifan enzim
terkadang memerlukan kofaktor (molekul tambahan) berupa koenzim
atau kofaktor. Koenzim adalah senyawa kofaktor yang merupakan
molekul organik.Sedangkan kofaktor adalah senyawa kofaktor atau
molekul tambahan yang merupakan molekul anorganik . Hubungan
antara koenzim , apoenzim , dan holoenzim adalah koenzim membantu
apoenzim yaitu enzim yang belum teraktivasi menjadi holoenzim yaitu
bentuk enzim yang sudah teraktivasi .
Mekanisme reaksi enzimatik dapat dirangkum menjadi
E+S ES E+P
Dengan E adalah enzim dan S adalah substrat . Kemudian ES
adalah kompleks enzim dan substrat dan P adalah produk . Saat di
awal enzim akan berikatan dengan substrat membentuk kompleks
enzim substrat dan saat sudah terjadi kecepatan reaksi maksimum yang
ditandai dengan konsentrasi substrat yang sudah mencapai kondisi
jenuh maka akan terbentuk produk dan enzim kembali ke keadaan
semula .
Pengikatan rekasi enzim dengan substrat dapat diterangkan melalui
dua teori yaitu lock and key model dan induced fit model . Pada lock
and key model terdapat asumsi spesifitas yang tinggi dari substrat dan
sisi aktif enzim sehingga substrat akan berikatan dengan sisi aktif
enzim jika bentuk ruangnya cocok dan bersifat komplementer . Namun
model ini sudah ditinggalkan karena tidak mempertimbangkan
flesbilitas konformasi enzim sebagai molekul protein . Model kedua
yaitu indunced fit model adalah model yang menyatakan pengikatan
subsrat akan menginduksi perubahan konformasi molekul enzim
sehingga mengahsilkan pasangan yang komplementer (complementary
fit)
Model reaksi enzimatik dapat diterangkan menurut persamaan
Michaelis-Manten yaitu
⌈ ⌉
⌈ ⌉

Dengan Vo adalah kecepatan reaksi mula-mula , Vmaks adalah

kecepatan maksimum saat substrat sudah mencapai kondisi jenuhnya ,
Kemudian ⌈ ⌉ adalah konsentrasi substrat dan Km adalah tetapan
Michaelis-Manten yang secara matematika sama dengan konsentrasi
substrat yang menghasilkan setengah Vmaks. Jika digambarkan dalam
bentuk kurva maka bentuk kurva dari persamaan Michaelis – Manten
adalah

Gambar 5.1 : Kurva Michaelis-Menten

Sumber : https://sv.wikipedia.org/wiki/Michaelis%E2%80%93Menten-kinetik
Untuk memudahkan dalam menentukan nilai dari Vmaks dan Km ,
maka dari persmaan Michaelis-Menten dibuat transformasi menjadi
persamaan Lineweaver-Burk dengan cara pada ruas kanan dan kiri
bagian bawah dibalik menjadi ke atas dan sebaliknya maka menjadi

[ ]
 Selanjutnya jika dibuat kurva akan menjadi

Gambar 5.2 : Kurva Lineweaver-Burk

Sumber : https://en.wikipedia.org/wiki/Lineweaver%E2%80%93Burk_plot

Maka dapat dilihat dari persamaan dan kurva jika diketahui

gradiennya maka akan diketahui nilai dari .

Faktor-faktor yang mempengaruhi kinetika enzim adalah

pH yaitu enzim akan teraktivasi dan bekerja pada pH maksimum
masing-masing seperti enzim amilase yang mengubah amilum menjadi
maltosa yang teraktivasi dan bekerja di pH 7,5 . Kemudian enzim
pepsin yang berfungsi untuk memecah molekul protein menjadi pepton
akan teraktivasi dan bekerja di pH 2 yang sesuai dengan pH di
lambung .Kemudian saat memasuki duodenum atau usus halus yang
pH basa akan menajdi inaktif . Selanjutnya suhu jadi enzim memiliki
suhu optimum untuk bekerja masing –masing ,umumnya berada pada
suhu yang rendah . Sebab enzim sebagian besar terdiri dari protein
yang jika dipanaskan umumnya enzim tidak akan bekerja karena
terjadi denaturasi protein . Faktor selanjutnya inhibitor yaitu senyawa
yang menghambat reaksi enzimatis sehingga reaksi enzimatis menjadi
tidak berjalan , aktivator yang membuat enzim menjadi teraktivasi
yaitu koenzim pada molekul organik dah kofaktor untuk molekul
anorganik , konsentrasi substrat dengan jika konsentrasi substrat
semakin tinggi maka reaksi berjalan dalam waktu lebih lama jika
variabel jumlah enzim tetap , konsentrasi enzim dengan jika
konsentrasi meningkat pada jumlah substrat yang sama maka akan
mempercepat terjadinya reaksi enzimatis .
Enzim diklasifikasikan menjadi 6 kelas berdasarkan fungsinya
yaitu Oksidoreduktase, transferase, hidrolase, liases, isomearses,
ligases. Kelompok Enzim oksidoreduktase adalah enzim yang
berfungsi untuk katalisis reaksi oksidasi dan reduksi, contohnya adalah
enzim katalase yang mengakatalisi reaksi reduksi H2O2 menjadi air
dan O2 . Kedua kelompok enzim transferase adalah enzim yang
mengkatalisis reaksi di mana transfer gugus fungsional antara dua
substrat berlangsung, contohnya adalah allanine aminotransferase
mampu mengubah asam amino alanin menjadi aspartate. Ketiga adalah
kelompok enzim hidrolase yang mengkatalisis reaksi hidrolisis
karbohidrat, protein, dan ester , contohnya adalah lipase enzim yang
mengkatalisis rekasi lemak menjadi gliserol dan asam lemak .
Keempat kelompok enzim liases adalah enzim-enzim yang
mengkatalis reaksi yang melibatkan penghapusan kelompok dari
substrat oleh proses selain hidrolisis oleh pembentukan ikatan ganda.
Contoh dari kelompok enzim liases adalah enzim piruvat
dekarboksilase yang mengubah piruvat menjadi asetil koA pada siklus
asam sitrat. Kelima adalah kelompok enzim isomerase adalah enzim-
enzim yang mengkatalisis reaksi di mana interkonversi isomer cis-
trans yang terlibat. Contohnya adalah maleat isomerase yang
mengkatalisis reaksi maleat menajdi fumarat . Kelompok terakhir
adalah enzim ligase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi di mana
kopling dua senyawa yang terlibat dengan memecah ikatan
pirofosfat.Contoh dari kelompok enzim ini adalah piruvat karboksilase
yang mengkatalisis reaksi asam piruvat menjadi asam oksaloasetat.
Pengaruh waktu inkubasi berfungsi dalam aktivator enzim , setiap
enzim memilki waktu inkubasi masing –masing . Dengan hasil
inkubasi yang optimum akan didapatkan jika semakin lamanya waktu
inkubasi . Waktu inkubasi pada enzim seperti contohnya pada enzim
alcase yang menghidrolisis protein pada hati tuna (Euthynnus affinis) ,
waktu inkubasi 240 menit lebih meningkatkan reaksi enzimatik dari
pada saat 60 menit. (Hall & Ahmad 1992; Liaset et al. 2000; Viera et
al. 1995).

Pada percobaan kinetika enzim akan dicari nilai Km dan Vmaks

dari reaksi antara enzim GOD PAP dan glukosa . Enzim GOD-PAP
adalah enzim glukosa oksidase yang mengkatalisis reaksi oksidasi
glukosa menjadi glukonolakton dan hydrogen peroksida .Enzim ini
termasuk dalam golongan enzim katalase . Enzim ini bekerja secara
spesifik dan memerlukan kofaktor FAD (Flavin adenina dinukleotida)
,air , dan O2 untuk melakukan rekasis katalisis glukosa . Mekanisme
enzim ini bekerja dapat dilihat dari reaksi di bawah ini
E

Enzim GOP-PAP dapat diperoleh dari Penicillium amagasakiensi,

P. notatum, P.funiculosum, P. piceum, dan Aspergillus niger. Enzim
ini bewarna kuning pucat pada keadaan kering dan murni . Pada suhu
0o C stabil selama 2 tahun. Pada suhu penyimpanan 25o C enzim
glukosa oksidase hanya stabil selama 8 bulan. Aktivitas enzim glukosa
oksidase hilang bila dipanaskan pada suhu diatas suhu 37o C . pH
optimum enzim glukosa oksidase adalah 5,6 dan larutan enzim glukosa
oksidase stabil pada kisaran pH 3 – 8. Jika di luar kisaran pH tersebut
enzim mengalami kerusakan lebih cepat.

Pertama enzim perlu diinkubasi selama 15 menit di inkubator

untuk membuat enzim menajadi teraktivasi . Kemudian enzim
diberikan glukosa yang berfungsi sebagai subsrat dengan 6 variabel
konsentrasi untuk mencari nilai Km dan Vmaks . Selanjutnya
ditambahkan air masing-masing pada tabung sebanyak 2 ml berfungsi
untuk berikatan dengan β-D-glukonat yang dihasilkan dari reaksi
antara glukosa dan koenzim FAD sehingga terbentuk Asam-D-
glukonat. Setelah itu enzim diukur nilai absorannya dengan
mengguanakan fotometer .Fotometer adalah sutu alat untuk dengan
menggunakan prinsip pengukurn penyerapan sinar akibat interaksi
sinar yang mempunyai panjang gelombang tertentu dengan Larutan tau
zat warna yang dilewatinya. Alat ini digunakan untuk mengukur kadar
dari glukosa yang sudah dikatalisis menjadi asam-D-glukonat .
Kemudian dimasukkan lagi ke dalam inkubator selama 5 menit dan
diukur kembali nilai absorbannya mengunakan fotometer . Kemudian
diukur nilai delta absorbansinya . Perbandingan nilai absorban dan
waktu akan mengahasilkan nilai . Kemudian dibuat plot konsentrasi
substrat dengan kecepatan reaksi .
Setelah dibuat plot dan diregresikan , didapatkan hasil persamaan
dengan y=0,0786x+29,112 dan R² = 0,1186. Berdasarkan perhitungan
nilai Km adalah 2,6999 x 10-3 dan Vmaks adalah 0,03435 adalah Nilai
R yang kecil membuktikan tidak terjadinya linearitas antara 1/s dan 1/v
sehngga tidak terdapat hubungan antara 1/s dan 1/v. Padahal
seharusnya terdapat hubungan antara 1/[S] dan 1/Vo . Hal ini
disebabkan karena terjadi kesalahan pemipetan pada saat pemipetan air
, pengukuran absorbansi pada waktu yang lebih dari t= 0 menit dan t=5
menit. Kemudian pengocokan anatara substrat , enzim dan air yang
kurang homogen sehingga saat pengukuran absorbansi substrat dan
enzim belum bereaksi sepenuhnya . Maka dari itu untuk selanjutnya
perlu dilakukan pengocokan antara substrat dan enzim secara homogen
, waktu pengukuran yang tepat , dan teknik pemipetan secara tepat dan
benar .
Selain itu dapat dilakukan pengamatan terhadap kinematika reaksi
dengan mengamati reaksi enzimais dari enzim tripsin yang mengubah
kasein menjadi asam amino dan oligopeptida. Pada percobaan tersebut
digunakan TCA yang berfungsi untuk menghentikan jalannya reaksi
hidrolisis antara enzim tripsin dan kasein dengan cara mendenaturasi
tripsin sehingga mampu menghentikan reaksi enzimatis karena
sifatnya yang asam. Sehingga selanjutnya rekasi enzmatis dapat
diamati . Lalu dapar fosfat untuk menajga pH optimum dari enzim
yang bekerja pada pH 8. Fungsi ragen Folin Ciocalteu untuk
membentuk warna kompleks yang terbentuk dari reaksi antara hasil
hidrolisis asam amino khususnya tirosin dengan reagen
Follin Cicolteau sehingga dapat diukur aktivitas enzim melalui
konsentrasi substrat yang sudah bereaksi seluruhnya menjadi produk.
Manfaat dari mempelajari kinetika enzim adalah karena banyak
proses kimia di dalam tubuh memerlukan enzim maka dapat dibuat
suatu inhibitor atau aktivator enzim jika diketahui mekanisme
reaksinya. Contoh obat untuk inhibitor enzim yaitu Aspirin
menginhibisi enzim COX-1dan COX-2 yang memproduksi pembawa
pesan peradangan prostaglandin, sehingga obat ini dapat menekan
peradangan dan rasa sakit . Kemudian obat trombolotika yang dapat
mengubah plasminogen menjadi plasmin . Plasmin adalah enzim yang
dapat menguraikan fibrin yang merupakan zat pengikat dari gumpalan
darah . Enzim ini diguanakan terutama pada kasus infark jantung akut
untuk melarutkan trombi yang telah menyumbat arteri koroner . Dalam
bidang diagnosis penyait enzim dapat berfungsi sebagai reagen untuk
diagnosis atau zat pembantu untuk diagnosis penyakit . Lalu dapat
menjadi pertanda (marker) dari kerusakan suatu jaringan atau organ
akibat penyakit tertentu.
V. Daftar Pustaka
A.P, Friman , P.Aryantha, I Nyoman . 2003. EKSPLORASI DAN
ISOLASI ENZIM GLUKOSA OKSIDASE DARI FUNGI INPERFEKTI
(GENUS Penicillium dan Aspergillus) INDIGENUS.Research Gate
Barker dan hirley.1980. Glucose oxidase, glucose dehydrogenase,
glucoseisomerase, galactosidase and invertase. In Microbial Enzyme
and Bioconversion, ed Rose, A.H. 173-226, London: Academic Press.
Campbell, Marry . 2009. Biochemistry 6 th edition . Belmont, Ca:
Thomson Higher Education . hal 143 -160 .
Hall, G.M. & Ahmad, N.H. 1992. Functional properties of fish protein
hydrolysates. Ch. 11 In Fish Processing Technology, diedit oleh Hall,
G.M. New York: Blackie Academic dan Professional.
Salwanee,S., Wan Aida, W.M, Mamot, S, Maskat dan S. Ibrahim,
M.Y. Effects of Enzyme Concentration, Temperature, pH and Time on
the Degree of Hydrolysis of Protein Extract from Viscera of Tuna
(Euthynnus affinis) by Using Alcalase. 2013. Sains Malaysiana
42(3)(2013): 279–287