Isolasi DNA Bakteri

12 ISOLASI DNA BAKTERI

Dasar Teori
Dalam rekayasa genetika, isolasi DNA kromosom adalah tahap yang
paling penting yang sering kali harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA
kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk diklon.
Basa nitrogen penyusun DNA terdiri dari basa purin, yaitu adenin (A) dan
guanin (G), serta basa pirimidin yaitu sitosin (S), dan timin (T). Ikatan gula-basa
disebut nukleosida, yaitu : (1) Ikatan A-gula disebut adenosin
deoksiribonukleosida (deoksiadenosin), (2) Ikatan G-gula disebut guanosin,
deoksiribonukleosida (deoksiguanosin), (3) Ikatan S-gula disebut sitidin
deoksiribonukleosida (deoksisitidin), dan (4) Ikatan T-gula disebut timidin
deoksinukleosida (deoksitimidin) (Syamsuri,2000).
Adapun menurut Watson dan Crick struktur heliks ganda seperti DNA
mempunyai ciri-ciri khas seperti tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang
basanya berpasangan dengan ikatan hidrogen, dengan aturan perpasangan A-T
dan G-C.
Pasangan A-T diikat oleh dua ikaan hidrogen, sedangkan G-C oleh tiga
ikatan hidrogen, perpasangan dengan ikatan hidrogen ini selain mengikat juga
mempertahankan jarak antara dua basa.

Sumber : Wikipedia, 2008

Gambar 1. Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin
danguanin dengan sitosin)
yang membentuk DNA beruntai ganda.

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 1

 Isolasi DNA Bakteri

Pasangan dua utasan DNA membentuk suatu pilinan disekitar suatu sumbu
dengan arah pilinan kekanan atau searah dengan arah jarum jam, setiap sepuluh
pasang basa akan membentuk satu pilinan.

Gambar 2 . Struktur molekul DNA

Sumber : gurungeblog.wodpres.com

DNA mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur

perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA berfungsi
untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang diperlukan untuk
mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies organisme.
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariotik (misalnya bakteri)
berbeda dengan struktur DNA eukariotik. DNA prokariotik tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariotik berbentuk linear dan
memiliki protein histon. Kromosom sel prokariot merupakan suatu molekul besar
DNA yang berkaitan erat menjadi suatu daerah inti atau nukleoid. DNA dalam
organisme prokariot umumnya tidak bergabung dengan protein selain protein
yang terlibat dalam replikasi atau transkripsi DNA. (Klug & Cummings 1994:
315--316; Raven & Johnson 2002: 94).
Bakteri merupakan salah satu jenis organisme prokaryotik yang tidak
memiliki membran inti. Bakteri berasal dari kata latin bacterium (jamak,
bacteria), yang berarti kelompok raksasa dari organisme hidup. Bakteri sangatlah

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 2

 Isolasi DNA Bakteri

kecil (mikroskopik) dan pada umumnya berbentuk uniselular (bersel tunggal),

dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, cytoskeleton, dan
organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.

Gambar 3. Beberapa contoh bakteri

Sumber : Wikipedia, 2008
Sel bakteri dikelilingi oleh membran plasma yang menbungkus sisi plasma
dan memisahkan sel dari lingkungan luar. Membran plasma terdiri dari lapisan
rangkap lipid yang mengandung protein terintegrasi di dalamnya. Protein ini
mengendalikan transport molekul masuk dan keluar sel dan mengkatalisis reaksi.
Adapun struktur dasar dari sel bakteri dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 4. Struktur dasar sel bakteri

Sumber : Sentotpras. 2009
Kebanyakan sel bakteri dikelilingi oleh dinding sel yang rigid (kaku).
Dinding sel ini tersusun dari peptidoglikan, suatu kompleks oligosakarida dan
protein. Kompleks oligosakarida terdiri dari unit ulang N-asetilglukosamin dan
asam N-metilmuranat (NAM). Ikatan silang pada dinding sel bakteri akan

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 3

 Isolasi DNA Bakteri

menghasilkan kekuatan dan kekakuan. Adanya asam D-amino pada peptidoglikan

menyebabkan dinding sel bakteri resisten terhadap aktivitas protease yang
umumnya bekerja pada asam L-amino, tetapi menyediakan sisi yang unik bagi
kerja antibiotik tertentu.
Isolasi DNA kromosom bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap
perusakan dan pembuangan dinding sel, lisis sel, pembuangan remukan sel, serta
pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat
dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya
digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan
sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-
masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse.
Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan,
misalnya dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. DNA hasil isolasi
dikatakan baik apabila mempunyai tingakt kemurnian yang tinggi dan tidak
mengalami fragmentasi.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi
dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi
yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di
dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang
bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Wikipedia,
2008).
Selain itu, untuk mengisolasi komponen makromolekul dari sel bakteri
harus memenuhi tiga tahap, yaitu tahap pertama adalah perusakan dinding sel dari
bakteri dan sistem membran selnya untuk membantu ekstraksi dari komponen
yang dikehendaki, tahap kedua adalah bekerja di dalam kondisi yang sesuai baik
itu dalam menghambat atau menhancurkan, sehingga banyak dihasilkan turunan
enzim selama perusakan sel bakteri. Sedangkan tahap terakhir adalah melakukan
pemisahan sehingga menghasilkan makromolekul yang diinginkan.
Isolasi DNA yang disajikan dalam prosedur ini, disusun berdasarkan hasil
eksperimen makmur pada tahun 1961. Spesifikasinya yaitu sel-sel bakteri dirusak

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 4

 Isolasi DNA Bakteri

dengan perlakuan awal dengan enzim, putih telur lisosim yang menghidrolisis
dinding sel bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah mudahnya
memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteti akan mengalami lisis
dalam lingkungan yang hipotonik. Kemudian penambahan detergen yang
mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan melengkapi lisisnya bakteri
dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga menghambat aktivitas
enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan aksi denaturasi dari
detergen. Sedangkan agen pengkhelat sitrat dan EDTA (Etilen Diamin Tetraacetic
Acid) lebih jauh dapat menghambat nukleolisis dengan mengembalikan ion logam
divalent yang diperlukan untuk aktivitas inti.
Pada akhirnya metode eksperimen ini menggunakan beberapa macam
metode pemisahan yang dapat memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri.
Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dan DNA. Sedangkan
kloroform isoamyl alcohol digunakan untuk denaturasi dan koagulasi protein
lebih jauh untuk sentrifugasi yang berbeda. Kemudian DNA akan diubah secara
selektif selama penambahan etanol yang menyebabkan menggulungnya serat
panjang DNA dari makromolekul yang lain, misalnya RNA dan protein yang
terkoagulasi dalam bentuk nonserat. DNA kasar yang diperoleh akhirnya
dilarutkan dan direpresipitasi dengan isopropanol dibawah kondisi yang hanya
mendukung presipitasi DNA.

TUJUAN
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengisolasi DNA dari bakteri.
Alat dan Bahan
Alat
Nama Alat Jumlah
Tabung reaksi 1 rak
Sentrifuse 1 buah
Batang pengaduk 1 buah
Gelas kimia 100 mL 3 buah
Gelas ukur 5 mL 1 buah
Pipet ukur 5 mL 1 buah

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 5

 Isolasi DNA Bakteri

Spatula 3 buah
Pipet tetes 2 buah
Labu ukur 100 mL 1 buah
Termometer 1 buah
Pemanas magnetik 1 buah
Gelas kimia 250 mL 1 buah

Bahan
Nama Bahan Jumlah
Isolat Bakteri 8 mL
Aquades Secukupnya
Kristal NaCl 0,8877 gram
Detergen 25 gram
Kristal KClO3 30,6395 gram

Prosedur Kerja
1. Penyiapan NaCl 0,15 M
 Sebanyak 0,8875 gram NaCl dilarutkan dalam aquades sampai volume
larutan 100 mL
2. Penyiapan Larutan Detergen 25%
 Sebanyak 12,5 gram detergen dilarutkan dengan 25 mL aquades
3. Pembuatan Larutan KClO3 5 M
 Sebanyak 6,1275 gram KClO3 dilarutkan dalam H2O. Bila tak melarut,
maka dibantu dengan pemanasan dan ditambahkan H2O kembali sampai
volumenya 10 mL
4. Penyiapan Bakteri dan Isolasi DNA Bakteri
 Bakteri dalam medium pertumbuhan dimasukkan ke dalam tabung I dan
II. Massa tabung terlebih dahulu ditimbang. Volume tabung yang
dimasukkan bakteri harus sama.
 Sentrifuse selama + 10 menit.
 Hasil sentrifuse didekantasi sehingga diperoleh endapan dan filtrat.
Endapan diambil sedikit dan dibuatkan preparat kemudian dilihat dengan

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 6

 Isolasi DNA Bakteri

mikroskop (menggunakan pembesaran 100x). Sedangkan filtrat

dikembalikan ke medium pertumbuhan bakteri.
 Endapan sisa dibuang
 Volume NaCl 0,15 M dimasukkan 1 : 12,5 (b/v) dengan massa bakteri
yang diperoleh di masing-masing tabung.
 Diinkubasi pada 700C sewlama 1 menit. kemudian ditambahkan dengan
larutan detergen dengan perbandingan 1 : 5 (v/v) 25%
 Dipanaskan kembali pada suhu 600C selama 10 menit
 Dinginkan pada suhu ruangan.
 Ditambahkan dengan KClO4 5,0 M (1:5) v/v. Dan didiamkan.
 Tambahkan dengan isoamyl kloroform dan sentrifuse.
 Dekantasi. Endapan digulung dengan batang pengaduk.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2008. Bakteri. http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri [22/05/2009].
Anonim. 2008. Isolasi DNA. http://id.wikipedia.org/wiki/Isolasi_DNA.
[22/05/2009].
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc.,
Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm.
Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills
Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.
Muderawan, I Wayan. 2007. Buku Ajar Analisis Instrumen. Singaraja :
Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja
Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia.
Singaraja: IKIP Negeri Singaraja.
Sentotpras. 2009. Bakteri, Ciri-ciri, Struktur, Perkembangbikan, Bentuk, dan
Manfaatnya. http://Gurungeblog.Wordpress.Com/2008/11/17/Bakteri-Ciri-
Ciri-Struktur-Perkembangbiakan-Bentuk-Dan-Manfaatnya/. [22/05/2009].
Suryo. 2008. DNA. http://mickeyamekan.blogspot.com/2009/02/dna-deoksiribo-
nucleic-acid.html. [22/05/2009].

Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas

Pendidikan Ganesha Singaraja

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA 7