LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

TITRASI FORMAL ASAM AMINO

OLEH :

NAMA : KADEK PEBRI ANGGRENI RISTIA DEWI

NIM : 1813081006

PRODI : S1 KIMIA

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

SINGARAJA

2020
I. Judul Praktikum
Titrasi Formal Asam Amino
II. Tujuan
- Untuk menentukan derajat hidrolisis suatu protein melalui titrasi formal
asam amino.
- Untuk menghidrolisis protein dengan enzim protease.
- Untuk membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu
dan kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal
asam amino.
III. Landasan Teori
Protein (akar kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling
utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein
mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur
serta fosfor. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino
tertentu dengan susunan yang sudah tertentu pula dan bersifat turunan.
(Aisjah Girindra: 1986)
Bila suatu protein dihidrolisis, akan di dapatkan asam aminonya.
Hidrolisis suatu protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim
protease dari tripsin. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam
amino bebas. Asam amino bebas ini bila direaksikan dengan formaldehid
berlebih akan membentuk derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam
amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari gugus NH3+ :

Gambar 1. Persamaan reaksi hidrolisis asam amino

 H+ yang dilepaskan pada reaksi di atas dapat dititrasi langsung dengan
NaOH sampai pH 8,0 (titik akhir indikator fenolftalein). Titrasi asam amino
atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan
titrasi formal asam amino. Titrasi ini merupakan metode anlisis untuk
mengikuti pembentukan asam amino bebas yang dihasilkan pada proses
hidrolisis protein oleh enzim proteotik.
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh
dari hasil hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama
hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino
bertambah terus. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat
memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis suatu protein.
Menurut teori zwitterion, kalau suatu asam amino dalam larutan dititrasi
dengan basa, berarti ion hidrogen dari amonium yang dititrasi. Gugus
amonium dari asam amino bersifat buffer pada daerah pH tinggi, di atas pH
11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga
tidak mungkin juga dititrasi dengan basa.
Untuk mengatasi hal tersebut, maka formaldehid ditambahkan kedalam
larutan asam amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak
bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer pada
daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara
kuantitatif menggunakan indikator.
Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah
 Gambar 2. Reaksi Keseluruhan Titrasi Formal Asam Amino

Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk

dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein
sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi titik akhir titrasi sehingga titik
akhir titrasi dapat ditentukan dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah
fenolftalein.
Pada praktikum ini digunakan reagen gelatin yang merupakan produk
alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan
protein yang larut dan bersifat gelling agent (bahan pembuat gel). Sumber
bahan baku gelatin dapat berasal dari tulang dan kulit dari sapi atau babi.
Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi besar, protein dan 4-hidroksi
residu.
IV. Alat dan Bahan
Adapun alat – alat yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu 3 buah
gelas kimia 100 mL, 3 buah Erlenmeyer 100 mL, 1 set buret dan statif, 1
 buah spatula, 1 buah batang pengaduk, 2 buah labu ukur 100 mL, 1 buah
pipet ukur 25 mL, 1 buah kaca arloji, 1 buah termometer, 1 buah pemanas
listrik, 2 buah pipet tetes, dan 1 buah labu ukur 25 mL.
Adapun bahan – bahan yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu
larutan gelatin 5% secukupnya, larutan NaOH 0,2M secukupnya, larutan
HCl 0,1M secukupnya, indikator PP 1% secukupnya, larutan formaldehida
40% secukupnya, larutan tripsin 1% secukupnya, dan aquades secukupnya.
V. Prosedur Kerja dan Hasil Pengamatan
No Prosedur Kerja Hasil Pengamatan
1 Sebanyak 100 mL larutan gelatin 100 mL larutan gelatin yang telah
disiapkan. disiapkan

2 Ditambahkan sebanyak 1 mL Larutan NaOH yang diperlukan

larutan PP ke dalam larutan sebanyak 87 tetes agar menimbulkan
gelatin, kemudian ditambahkan warna merah muda.
dengan larutan NaOH 0,2M tetes
demi tetes hingga timbul warna
merah muda.
3 Selanjutnya ditambahkan tetes Larutan HCl yang diperlukan
demi tetes larutan HCl 0,1M sebanyaj 48 tetes untuk
sampai warna merahnya hilang. menghilangkan warna merah.

4 Kemudian larutan tersebut Proses inkubasi dalam inkubator pada

direndam dalam inkubator air suhu 38℃.
pada suhu 38℃.
5 Selanjutnya pada tabung lain, Sebanyak 10 tetes fenolftalein dan
sebanyak 25 mL larutan tripsin sebanyak 20 tetes larutan NaOH
ditambahkan dengan beberapa diperlukan untuk menimbulkan warna
tetes fenolftalein dan ditambahkan merah muda.
 tetes demi tetes larutan NaOH
0,2M sampai timbul warna merah
muda.

6 Kemudian ditambahkan tetes Larutan HCl yang diperlukan untuk

demi tetes larutan HCl 0,1M ke menghilangkan warna merah adalah
dalam larutan tersebut sampai sebanyak 23 tetes.
warna merah hilang.
7 Setelah itu larutan diinkubasi Proses inkubasi dalam inkubator pada
dalam inkubator air pada suhu suhu 38℃
38℃ selama beberapa menit.
8 Kemudian larutan tripsin Campuran antara larutan tripsin dan
ditambahkan ke dalam larutan larutan gelatin.
gelatin dan diaduk secara
perlahan.
9 Setelah tercampur merata, Sebanyak 10 mL campuran
campuran diambil sebanyak 10 dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100
mL dan dimasukkan ke dalam mL.
Erlenmeyer 100 mL (larutan
digunakan sebagai control atau
waktu nol).
10 Kemudian dididihkan untuk Proses merusak enzim dengan cara
merusak enzim dan setelah itu dididihkan dan lalu didinginkan.
didinginkan.
11 Selanjutnya sebanyak 15 mL Proses titrasi dengan NaOH dan
formalin netral dan 3 tetes penambahan 15 mL formalin netral
fenolftalein ditambahkan dan serta 3 tetes fenolftalein.
kemudian dititrasi dengan NaOH
0,02M.
 12 Pada interval waktu 15, 30, 45, 60, Waktu Volume NaOH
75, 90 menit dari waktu nol 0 menit 0,6 mL
dilakukan hal yang sama seperti 15 menit 0,8 mL
pada kontrol. 30 menit 1,3 mL
45 menit 1,4 mL
60 menit 1,9 mL
75 menit 2,1 mL
90 menit 2,5 mL

VI. Hasil dan Diskusi

Derajat hidrolisis protein (gelatin) oleh enzim protease dari tripsin dapat
ditentukan dengan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino ini
pada prinsipnya adalah titrasi asama basa, sehingga formalin, tripsin, dan
gelatin yang digunakan pada percobaan harus dinetralkan terlebih dahulu
agar tidak mengganggu hasil percobaan nantinya. Kondisi bahan-bahan
yang tidak netral dapat merubah kebutuhan NaOH dalam mentitrasi sampel
dan dapat menyebabkan data yang diperoleh tidak valid.
Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M.
Penambahan larutan NaOH dihentikan ketika warna larutan telah menjadi
merah muda yang ditimbulkan oleh adanya indikator PP dalam suasana
basa. Tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan gelatin bersifat basa.
Kemudian larutan ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai warna
merah muda larutan hilang (pH 8,0). Pada pH 8,0 larutan gelatin akan
mampu bereaksi dengan sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin.
Pada pH 8 merupakan pH yang optimum bagi enzim untuk menghasilkan
asam amino.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap larutan enzim protease
(tripsin). Tujuan menjaga pH larutan 8,0 adalah untuk mengaktifkan enzim
tripsin dalam memecah protein (gelatin), karena tripsin bekerja efektif pada
pH 7,7-8,0. Di samping itu, agar terjadi hidrolisis secara sempurna antara
gelatin dengan tripsin, kedua larutan juga diinkubasi pada suhu 38℃,
karena enzim protease dapat bekerja optimal pada suhu ini.
Larutan gelatin dan larutan tripsin kemudian dicampurkan dan larutan
ditempatkan pada labu Erlenmeyer dan dimasukkan dalam inkubator air
pada suhu 38℃ sehingga terjadi pemecahan protein menjadi asam amino.
Campuran ini adalah kontrol dan waktu ke nol.
Pada waktu ke 0, 15, 30,45, 60, 75, dan 90 menit diambil sebanyak 10
mL larutan (campuran gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada
masing-masing interval waktu yang bertujuan untuk merusak protein.
Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada masing-masing
interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator
PP kemudian dilakukan titrasi.
Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan menggunakan formalin
merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol
ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi
reaksi yang terjadi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH)
sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang
digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir titrasi diperoleh tepat, maka
akan terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda.
Derajat hidrolisis dapat ditentukan dengan membuat kurva hubungan
antara volume NaOH yang dipergunakan dalam titrasi terhadap waktu.
Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen. Nilai tangen
tersebut merupakan daya hidrolisis enzim tripsin. Selama melakukan titrasi
formal asam amino volume NaOH yang diperlukan pada menit ke- 0, 15,
30, 45, dan 60 adalah sebagai berikut.
 Tabel 1. Hubungan Waktu dengan Volume NaOH
Waktu Volume NaOH
0 menit 0.6 mL
15 menit 0.8 mL
30 menit 1,3 mL
45 menit 1,4 mL
60 menit 1,9 mL
75 menit 2,1 mL
90 menit 2,5 mL

Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat kurva hubungan antara

volume NaOH yang diperlukan terhadap waktu yaitu sebagai berikut.

Kurva Titrasi
3 2.5
2.5 2.1
1.9
volume NaOH

2
1.3 1.4
1.5
0.8
1 0.6
0.5
0
0 20 40 60 80 100

Waktu
volume NaOH Linear (volume NaOH)

Gambar 3. Kurva Hubungan antara Volume NaOH Terhadap Waktu

Kurva tersebut menunjukan bahwa semakin lama larutan didiamkan,
maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi
larutan asam amino tersebut. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis
gelatin oleh tripsin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang
dihasilkan semakin banyak. Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah
NaOH yang digunakan pada saat titrasi juga bertambah. Akan tetapi pada
batas waktu tertentu, kurva akan mulai konstan apabila enzim sudah
mencapai titik jenuhnya sehingga tidak mampu lagi untuk mengikat asam-
asam amino yang bebas.
 Berdasarkan data diatas dapat ditentukan derajat hidrolisisya yaitu
sebagai berikut.
∆ 𝑉 𝑁𝑎𝑂𝐻
tg = ∆𝑡
(2,5−0,6)
tg = (90−0)

tg = 0,021
Berdasarkan hasil titrasi tersebut, dapat dibuat kurva mg nitrogen asam
amino terhadap waktu yang diperlukan larutan gelatin untuk bereaksi. mg
nitrogen asam amino menyatakan jumlah asam amino yang dapat
dihidrolisis oleh enzim tripsin. Sebelum membuat kurva, mg nitrogen
terlebih dahulu dihitung dengan ketentuan 1 mL NaOH yang digunakan
dalam titrasi ekuivalen dengan 0,28 mg nitrogen asam amino.
 Pada 0 menit, VNaOH = 0,6 mL, maka 0,6 x 0,28 = 0,168 mg
 Pada 15 menit, VNaOH = 0,8 mL, maka 0,8 x 0,28 = 0,224 mg
 Pada 30 menit, VNaOH = 1,3 mL, maka 1,3 x 0,28 = 0,364 mg
 Pada 30 menit, VNaOH = 1,4 mL, maka 1,4 x 0,28 = 0,392 mg
 Pada 60 menit, VNaOH = 1,9 mL, maka 1,9 x 0,28 = 0,532 mg
 Pada 75 menit, VNaOH = 2,1 mL, maka 2,1 x 0,28 = 0,588 mg
 Pada 90 menit, VNaOH = 2,5 mL, maka 2,5 x 0,28 = 0,7 mg
Berdasarkan perhitungan diatas, diperoleh data mengenai mg nitrogen
terhadap waktu seperti tabel dibawah ini.
Tabel 2. Data mg Nitrogen yang Dihasilkan Oleh Asam Amino
Waktu Volume NaOH mg nitrogen
(mL) asam amino
0 menit 0.6 mL 0,168
15 menit 0.8 mL 0,224
30 menit 1,3 mL 0,364
45 menit 1,4 mL 0,392
60 menit 1,9 mL 0,532
75 menit 2,1 mL 0,588
90 menit 2,5 mL 0,7
 Berdasarkan data diatas, dapat dibuat kurva hubungan antara mg
nitrogen yang dihasilkan oleh asam amino terhadap waktu yaitu sebagai
berikut.

0.8 0.7
0.7 0.588
0.6 0.532
mg nitrogen

0.5 0.364 0.39

0.4
0.3 0.224
0.2
0.1 0
0
0 20 40 60 80 100

Waktu
mg nitrogen Linear (mg nitrogen)

Gambar 4. Kurva Hubungan antara mg Nitrogen Terhadap Waktu

Kurva di atas menunjukkan peningkatan jumlah mg nitrogen asam
amino seiring dengan bertambahnya waktu kontak antara larutan gelatin
dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin lama menghidrolisis
gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan
semakin banyak, sehingga nitrogen yang terdapat pada dimetilol juga ikut
bertambah.
VII. Simpulan
Berdasarkan dari hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa
protein (gelatin) dapat dihidrolisis dengan enzim protease dari tripsin dan
melalui titrasi formal asam amino yang mana derajat hidrolisisnya
diperoleh sebesar 0,021. Dapat dibuat dua kurva yaitu kurva hubungan
antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva hubungan mg nitrogen
asam amino terhadap waktu yang mana kurva tersebut dibuat berdasarkan
dari data hasil titrasi formal asam amino. Semakin lama larutan didiamkan,
maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi
 larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari
asam amino yang dihasilkan.
VIII. Pertanyaan
1) Mengapa asam amino disebut monomer Protein?
Jawab : Asam amino disebut monomer protein karena suatu molekul
protein tersusun atas sejumlah asam amino tertentu dengan
susunan yang khusus.
2) Bila suatu protein dihidrolisis?
Jawab : Maka akan didapatkan asam aminonya yang mana hidrolisis
suatu protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim
protease dari tripsin.
3) Mengapa titrasi perlu ditambahkan aldehida?
Jawab : Titrasi perlu ditambahkan aldehida karena untuk
memungkinkan gugus ammonium dari asam amino
membuffer pada daerah pH yang lebih rendah sehingga
dapat dititrasi sampai titik akhir.
4) Substrat dalam percobaan ini sebutkan?
Jawab : Substrat dalam percobaan ini adalah gelatin
5) Tuliskan kurva titrasi dalam percobaan ini ?
Jawab : Kurva titrasi dalam percobaan ini sebagai berikut

Kurva Titrasi
3 2.5
2.5 2.1
1.9
volume NaOH

2
1.3 1.4
1.5
0.8
1 0.6
0.5
0
0 20 40 60 80 100

Waktu
volume NaOH Linear (volume NaOH)
6) Pada pH berapa titik akhir titrasi untuk gugus karboksilat mengapa?
Jawab : Diatas pH 11 karena jika gugus karboksilat berada pada pH
dibawah 11 maka larutan akan bersifat buffer dan tidak
mungkin untuk dititrasi hingga titik akhir.
7) Buatlah kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease.?
Jawab : Kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease yaitu
:

8) Apakah tujuan penambahan formaldehid dan tuliskan reaksinya?

Jawab : Tujuan dari penambahan formaldehid adalah untuk membentuk
dimetilol. Yang man larutan protein yang telah dinetralkan
dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formaldehid
sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol
ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan
mempengaruhi reaksi antara karboksil (asam) dengan basa
(NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat.
Adapun reaksinya adalah :
IX. Daftar Pustaka
Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga
Girindra, Aisjah.1993. Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia
Tika, I Nyoman. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja:
Universitas Pendidikan Ganesha.