PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh : I PUTU RAIWATA MERTANJAYA (NIM: 0813031019)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA SINGARAJA 2011

PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO Oleh: I Putu Raiwata Mertanjaya Jurusan Pendidikan Kimia, Undiksha

ABSTRAK Protein dapat dihidrolisis menjadi asam amino menggunakan enzim protease melalui titrasi formal asam amino. Penentuan salah satu gugus akan memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis suatu protein. Dalam titrasi ini, digunakan formaldehid yang bertujuan untuk membentuk dimetilol sehingga gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara gugus karbonil (asam) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Selain itu, agar dapat bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer di daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Sehingga akan didapatkan kurva hubungan banyaknya larutan NaOH yang digunakan terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen. Nilai tangen tersebut merupakan daya hidrolisis suatu protein (gelatin). Derajat hidrolisis protein oleh enzim protease adalah 0,059. Kata-kata kunci : asam amino, formaldehid

ABSTRACT Proteins can be hydrolyzed into amino acids using the enzyme protease through formal titration of amino acids. Determination of one group will give an indication to determine the degree of hydrolysis of a protein. In this titration, which aims to use formaldehyde to form dimethylol so that the amino group that has been tied does not affect the reaction between the carbonyl group (acid) with a base (NaOH) so that the end point of titration can be terminated properly. In addition, in order to react with an uncharged amino group allowing ammonium group buffering at a lower pH region and can be titrated at the end point quantitatively using an indicator. So that would be obtained curve number NaOH solution used with respect to time. Based on these curves are determined slope and tangent. Tangent value is the hydrolysis of a protein (gelatin). The degree of hydrolysis of proteins by protease enzyme is 0.059. Key words: amino acids, formaldehyde

PENDAHULUAN Protein merupakan senyawa organik kompleks yang mempunyai bobot molekul tinggi dan merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida (Tika, 2010). Bobot molekul protein sangat besar, tetapi hidrolisis asam semua protein menghasilkan sekelompok senyawa organik sederhana dengan bobot molekul rendah, yaitu -asam amino. Molekul-molekul building block ini minimum mengandung satu gugus karboksilat dan satu gugus -amino, serta satu gugus rantai samping R yang berbeda. Protein dalam makanan bisa kita temukan dalam kacang-kacangan, telur, dan lain sebagainya. Salah satu contoh protein yang sering kita temukan dalam kehidupan sehari-hari adalah telur. Kandungan penyusun telur dalam dibagi menjadi protein putih telur dan protein kuning telur. Komposisi putih telur kandungan total protein 10-11% dasar basah, ovalbulmin 70% dari total protein, canalbumin 9% dari total protein, ovoummucoid 13% dari total protein. Sedangkan kuning telur terdiri atas hipovitelin dan hipotellenin. Protein dapat dipecah menjadi asam-asam amino melalui suatu cara yaitu dengan hidrolisis. Apabila suatu protein mengalami hidrolisis, maka asam-asam amino penyusunnya akan teruraikan. Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Asam amino bebas yang dihasilkan dari hidrolisis ini apabila direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilahan satu proton dari gugus NH3+ (Tika, 2010). H3N+CHRCOOH2NCHRCOO- + H+ (HOCH2)2NCHRCOO(Tika, 2010). H2NCHRCOO- + 2HCHO

Asam amino merupakan ion dipolar, yang pada umumnya mempunyai dua atau lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, memiliki kadar asam amino yang tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar, dan dalam air menunjukkan struktur kutub ganda ( zwitter-ion), yaitu:

R CH COOH NH2

R CH COONH3+

Gambar 1 . Struktur dipolar asam amino (Nurlita, 2002). Pada gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi.

Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan protonnya pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan gugus amino dan satu gugus karboksil.

R CH COOH HO- R CH COO- HO- R CH COOH+ H+ NH2 NH3+ NH3+

Asam amino pada pH rendah bentuk ion dipolar asam amino pada pH tinggi

Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH Titrasi formal asam amino adalah metode penetapan asam amino berupa titrasi dengan larutan basa setelah ditambahkan larutan formaldehid untuk menghilangkan kebasaan gugus amino. Pada titrasi ini akan diperoleh kurva titrasi asam amino dari hasil hidrolisis protein menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino terus bertambah. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis dari suatu protein. Menurut teori zwitter-ion apabila suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Gugus amonium dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya dengan asam (Tika, 2007). Oleh karena itu, ditambahkan formaldehid pada larutan asam amino tersebut agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Dimana larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan formaldehid sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara karboksil (asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat, ditandai dengan perubahan warna larutan dari tidak berwarna menjadi merah muda yang tidak hilang selama 30 detik. Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut.

O O NaOH R CH C R CH C OH ONH2 NH3+

(pada pH netral)
R O C + HCHO Oformalin + NH3 CH R H CH OH N CH2OH HCHO R HOH2C CH OH N CH2OH C O C O

dimethilol

R CH C HOH2C

OH + NaOH N CH2OH

R CH C HOH2C

O-Na+ N CH2OH

Gambar 3. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid Reagen yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelatin, yang merupakan produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin adalah protein larut dan bersifat gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai ion gelling agent. Sumber bahan baku gelatin dapat berasal dari tulang dan kulit sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi besar, protein dan 4-hidroksiresidu. Tipe strukturnya yaitu Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-4.Hyp-GlyPro. Struktur gelatin adalah sebagai berikut:
O NH CH CH3 C NH CH2 O C N O C NH CH CH2 CH2 NH C NH2 NH2+ O C NH CH2 O C NH CH CH2 CH2 C OO CHO NH CH2 C N O O C O C N OH

Gambar 4. Struktur gelatin (Tika, 2010)

TUJUAN DAN MANFAAT Tujuan Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk (1) menghidrolisis protein dengan enzim protease dan menentukan derajat hidrolisisnya, (2) membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu, dan (3) membuat kurva mg nitrogen asam amino terhadap waktu pada titrasi formal asam amino. Manfaat Manfaat percobaan ini bagi praktikan adalah (1) mengetahui cara hidrolisis protein dengan enzim protease, (2) mengetahui cara menentukan derajat hirolisis protein oleh enzim protease, dan (3) memperkuat pemahaman tentang hidrolisis protein oleh enzim protease.

METODE Waktu dan Tempat Percobaan ini dilakukan pada hari Rabu, tanggal 23 Maret 2011 dari pukul 08.0012.30 WITA, bertempat di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Pendidikan Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini dapat dilihat pada tabel berikut. Tabel 1. Alat dan Bahan Nama Alat Gelas kimia 50 mL Gelas kimia 100 mL Labu Erlenmeyer Buret 50 mL dan statif Gelas ukur 25 mL Batang pengaduk Kaca arloji Termometer (100oC) Pemanas Listrik Pipet tetes Indikator universal Jumlah 1 buah 3 buah 3 buah 1 set 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah 1 buah Nama Bahan Larutan Gelatin Larutan NaOH 0,2 M Larutan HCl 0,1 M Indikator PP Larutan Formalin Larutan Tripsin Aquades NaOH 0,02 M Jumlah 50 mL 100 mL 50 mL 10 mL 5 mL 20 mL 500 mL 100 mL

Prosedur Kerja Sebanyak 100 mL larutan gelatin disiapkan, dan ditambahkan 1 ml larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai warna merah muda timbul. Larutan HCl 0,1 M ditambahkan tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang. Larutan gelatin direndam dalam inkubator air pada suhu 38oC. Pada gelas kimia lain, sebanyak 25 mL larutan tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes indikator PP dan tetes demi tetes larutan NaOH 0,2 M sampai warna merah muda timbul. Kemudian diteteskan larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda hilang. Larutan tripsin direndam dalam inkubator air pada suhu 38 oC selama beberapa menit. Larutan tripsin ditambahkan kedalam larutan gelatin kemudian diaduk secara perlahan. Sebanyak 10 mL dari campuran tersebut diambil dan dimasukkan kedalam labu erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan sebagai kontrol atau waktu nol menit). Campuran dididihkan untuk merusak enzim dan setelah itu didinginkan. Sebanyak 15 mL formalin netral dan 3 tetes larutan pp ditambahkan. Pada interval waktu 15, 30, 60, dan 90 menit dari waktu nol dilakukan hal yang sama seperti pada kontrol. Titrasi dilakukan pada larutan tersebut dengan larutan NaOH 0,02 M sampai titik akhir titrasi yang ditandai dengan timbulnya warna merah muda.

HASIL DAN PEMBAHASAN Derajat hidrolisis protein (gelatin) oleh enzim protease dari tripsin dapat ditentukan dengan titrasi formal asam amino. Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan NaOH 0,2 M. Penambahan larutan NaOH dihentikan ketika warna larutan telah menjadi merah muda yang ditimbulkan oleh adanya indikator PP dalam suasana basa. Tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan gelatin bersifat basa. Kemudian larutan ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda larutan hilang (pH 8,0). Pada pH 8,0 larutan gelatin akan mampu bereaksi dengan sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin. Pada pH 8 merupakan pH yang optimum bagi enzim untuk menghasilkan asam amino. Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap larutan enzim protease (tripsin), perlakuan. Tujuan menjaga pH larutan 8,0 adalah untuk mengaktifkan enzim tripsin dalam memecah protein (gelatin), karena tripsin bekerja efektif pada pH 7,7-8,0. Di samping itu, agar terjadi hidrolisis secara sempurna antara gelatin dengan tripsin, kedua larutan juga diinkubasi pada suhu 38 oC, karena enzim protease dapat bekerja optimal pada suhu ini. Larutan gelatin dan larutan tripsin kemudian dicampurkan dan larutan ditempatkan pada labu Erlenmeyer dan dimasukkan dalam inkubator air pada suhu 38 oC sehingga terjadi pemecahan protein menjadi asam amino. Campuran ini adalah kontrol dan waktu ke nol.

Pada waktu ke nol, 15, 30,45, 60, 75, dan 90 menit diambil sebanyak 10 mL larutan (campuran gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada masing-masing interval waktu yang bertujuan untuk merusak protein. Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada masing-masing interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator PP kemudian dilakukan titrasi. Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Dimana, larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH), kemudian ditambahkan sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara karboksil (asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Di samping itu, untuk memungkinkan gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir suatu indikator. Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut.

O O NaOH R CH C R CH C OH ONH2 NH3+

(pada pH netral)
R O C + HCHO Oformalin NH3+ CH R H CH OH N CH2OH HCHO R HOH2C CH OH N CH2OH C O C O

dimethilol

R CH C HOH2C

OH + NaOH N CH2OH

R CH C HOH2C

O-Na+ N CH2OH

Gambar 5. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid Secara teoritis menurut teori zwitter-ion, kalau suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Karena gugus amonium dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya dengan asam (Tika, 2007).

Dalam percobaan ini, larutan gelatin didegradasi dengan menggunakan enzim tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang terdiri dari satu rantai polipeptida. Enzin ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya. Reaksinya digambarkan sebagai berikut:
O NH CH CH3 C NH CH2 O C N O C NH CH CH2 CH2 NH C NH2 + NH2 O C NH CH2 O C NH CH CH2 CH2 C OO CHO NH CH2 C N O O C O C N OH

Gambar 6. Struktur Gelatin

O NH CH CH3 C OH +
NH2 CH2

O C

OH

NH2

OH

O OH

NH2

CH CH2 CH2 NH C

NH2

CH2

OH

NH2

NH2+ O

NH2

CH CH2 CH2 C OH

OH

NH2

OH

NH2

O C OH

CHO

NH CH2 C OH O

Gambar 7. Asam-asam amino hasil pemecahan gelatin Reaksi degradasi diatas dapat terjadi apabila terjadi hidrolisis total dari asam amino tersebut. Pada tahap titrasi, indikator yang digunakan adalah PP. Titrasi formal ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein. Dalam titrasi ini secara teori, semakin lama reaksi antara gelatin dengan tripsin maka makin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi banyaknya asam

amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan bertambahnya kontak antara larutan gelatin dan tripsin. Daya hidrolisis dapat ditentukan dengan membuat kurva hubungan antara volume NaOH yang dipergunakan dalam titrasi terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen. Nilai tangen tersebut merupakan daya hidrolisis enzim tripsin. Tabel 2. Hubungan Waktu dengan Volume NaOH Waktu (menit) 0 15 30 45 60 75 90 Volume NaOH 0,2 M (mL) 15,20 15,35 17,00 18,60 19,41 20,20 20,55

Hubungan antara volume NaOH yang digunakan dalam titrasi terhadap waktu dapat dilihat pada grafik berikut

Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Volume NaOH 0,02 M (mL) 25 20 15 y = 0.067x + 15.02 R = 0.958

10
5 0 0 20 40 60 80 100

Series1 Linear (Series1)

Waktu (menit)

Gambar 8. Kurva Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Daya hidrolisis dari enzim tripsin dalam titrasi formal ini adalah:
tg 20,55 15,20 90

5,35 90

= 0,059 Karena 1 mL NaOH 0,1 N sama dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka:
0,02 X 0,1 1,4 0,1X 0,028 X 0,28mg

Jadi 1 mL larutan NaOH 0,02 N ekivalen dengan 0,28 mg nitrogen asam amino. Pada 0 menit, VNaOH = 15,20 mL, maka 15,20 x 0,28 = 4,2560 mg Pada 15 menit, VNaOH = 15,35 mL, maka 15,35 x 0,28 = 4,2980 mg Pada 30 menit, VNaOH = 17,00 mL, maka 17,00 x 0,28 = 4,7600 mg Pada 30 menit, VNaOH = 18,60 mL, maka 18,60 x 0,28 = 5,2080 mg Pada 60 menit, VNaOH = 19,32 mL, maka 19,41 x 0,28 = 5,4348 mg Pada 75 menit, VNaOH = 20,20 mL, maka 20,20 x 0,28 = 5,6560 mg Pada 90 menit, VNaOH = 20,55 mL, maka 20,55 x 0,28 = 5,7540 mg

Waktu (menit)

Jumlah Nitrogen Asam Amino (mg)

0 15 30 45 60 75 90

4,2560 4,2980 4,7600 5,2080 5,4348 5,6560 5,7540

Kurva hubungan antara jumlah nitrogen asam amino terhadap waktu dapat dilihat pada grafik berikut.

Hubungan antara Waktu dengan mg Nitrogen Asam Amino

Jumlah mg Nitrogen Asam Amino (mg) 7.000 6.000 5.000 4.000 y = 0.018x + 4.207 R = 0.958

3.000
2.000 1.000 0.000 0 20 40 60 80 100

Series1 Linear (Series1)

Waktu (menit)

Gambar 9. Grafik Hubungan Waktu dengan Jumlah Nitrogen Asam Amino

SIMPULAN Titrasi formal asam amino dapat digunakan untuk menentukan derajat hidrolisis protein oleh enzim protease (tripsin). Derajat hidrolisis enzim protease adalah 0,059. Jumlah asam amino yang terurai bertambah sesuai pertambahan waktu, dibuktikan dengan meningkatnya penggunaan NaOH dalam titrasi seiring pertambahan waktu.

DAFTAR PUSTAKA Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja : IKIP N Singaraja. Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: IKIP Negeri Singaraja. Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha. -------. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha