TITRASI FORMAL ASAM AMINO

I.

II.

Tujuan
1. Menghidrolisis protein dengan enzim protease
2. Membuat kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg
nitrogen asam amino terhadap waktu titrasi formal asam amino
Dasar Teori
Protein adalah senyawa organik kompleks yang memiliki bobot molekul tinggi
yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan
satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon,
hydrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Suatu molekul
protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang sudah
tertentu pula dan bersifat turunan (Aisjah Girindra dalam Tika, 2010).
Asam amino merupakan ion dipolar yang pada umumnya mempunyai dua atau
lebih pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, kadar asam aminonya
tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam
amino tidak larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar dan dalam air
menunjukkan struktur kutub ganda (Zwitter ion) yaitu:
H
R

C
NH 2

H
COOH

COO -

NH 3+

Gambar 1. Struktur dipolar asam amino

Dari gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion ammonium,
sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat.
Struktur ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki
titik leleh agak tinggi.
Asam amino bersifat amfoterik artinya berperilaku sebagai asam dan
mendonasikan proton pada basa kuat atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan
menerima proton dari asam kuat. Prilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut
untuk asam amino dengan gugus amino dan satu gugus karboksil:

H
R

H
COOH

NH 3+

OHH+

COO -

OHH+

NH 3+

asam amino pada

pH rendah

Bentuk ion dipolar

COO -

NH 2

asam amino pada

pH tinggi

Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH

Bila suatu protein dihidrolisis, akan didapatkan asam aminonya. Hidrolisis protein
dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari tripsin. Protein jika
dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino bebas ini bila
direaksikan dengan formaldehid berlebih akan membentuk derivate metilol. Reaksi
ini menyebabkan asam amino bebas bentuk isoelektrik kehilangan satu proton dari
gugus NH3+ (Tika, 2010).
NH3+CHRCOO- H2NCHRCOO- + H+
H2NCHRCOO- + 2HCHO (HOCH2)2NCHRCOO+
H yang dilepaskan pada reaksi ini dapat dititrasi langsung dengan NaOH sampai
dengan pH 8,0 (titik akhir indicator ekuivalen). Titrasi asam amino atau campuran
asam amino dalam keberadaan formaldehid disebut dengan titrasi formal asam amino.
Titrasi ini merupakan metode analisis untuk mengikuti pembentukan asam amino
bebas yang dihasilkan pada proses hidrolisis protein oleh enzim proteotik (Tika,
2010).
Pada percobaan ini dibuat kurva titrasi dari asam amino yang diperoleh dari hasil
hidrolisis protein dengan menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu
protein, sejumlah gugus karboksil dan gugus amino bertambah terus. Penentuan
secara kuantitatif salah stau gugus akan dapat memberikan indikasi untuk mengetahui
derajat hidrolisis protein. Menurut teori zwiiterion, kalau suatu asam amino dalam
larutan dititrasi dengan basa, berarti ion hydrogen dari ammonium yang dititrasi.
Gugus ammonium dari asam amino yang bersifat buffer pada daerah pH tinggi atau di
atas pH 11, sehingga tidak mungkin dititrasi sampai titik akhir. Hal yang sama juga
terjadi pada gugus karboksil yang bersifat buffer pada pH rendah sehingga tidak
mungkin juga dititrasi dengan basa (Tika, 2010).

Untuk mengatasi hal tersebut, maka formaldehid ditambahkan ke dalam larutan

asam amino agar bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga
memungkinkan gugus ammonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan
dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan indicator (Tika, 2010).
Reaksi yang terjadi selama titrasi formal asam amino adalah :
H
R

O
COO-

C
H

NH 3 +

COOH

CH 2 OH

O
C
H

H
R

COOH

HOH2 C

CH 2 OH

dimethilol

COOH

HOH 2C

CH 2OH

+ NaOH

COO -Na+

HOH 2C

CH 2OH

+ H2O

Gambar 3. Reaksi selama Proses Titrasi Formal Asam Amino

Penambahan formalin ke dalam larutan asam amino akan membentuk dimetilol.

Dengan terbentuknya dimetilol berarti gugus amino dari protein sudah terikat dan
tidak akan mempengaruhi titik akhit titrasi sehingga titik akhir titrasi dapat ditentukan
dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolptalein (Tika, 2010).
Pada praktikum ini digunakan reagen gelatin yang merupakan produk alami yang
diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin merupakan protein yang larut dan
bersifat gelling agent (bahan pembuat gel). Sumber bahan baku gelatin dapat berasal
dari tulang dan kulit dari sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi
besar, protein dan 4-hidroksi residu.
Struktur gelatin adalah sebagai berikut :

O
N
H

H
C

O
H
N

H2
C

O
NH

CH 3

O
H
N

H
C

O
H
N

H2
C

O
H
N

H
C

CH2

CH2

CH2

CH2

NH

NH

OH
N

HC
O

O-

OH

NH
CH2
C
NH

NH2 +

O
C

Gambar 4. Struktur Gelatin

III.

Alat dan Bahan

1. Alat alat
No
1
2
3
4
5
6
7
8

Nama Alat
Gelas Kimia
Buret
Statif dan Klem
Erlenmeyer
Inkubator Air
Gelas Ukur
Labu Ukur
Termometer

Ukuran
100 dan 500 mL
50 mL
100 mL
50 dan 10 mL
100 dan 500 mL
100oC

Jumlah
4 buah
1 buah
1 set
3 buah
1 buah
2 buah
2 buah
1 buah

Konsentrasi
5%
0,2 M dan 0,02 M
0,1 M
1%
40 %
1%
-

Jumlah
100 mL
200 mL
50 mL
10 mL
100 mL
15 mL
300 mL

2. Bahan- Bahan
No
1
2
3
4
5
6
7
IV.

Nama Bahan
Larutan gelatin
Larutan NaOH
Larutan HCl
Larutan fenol ftalein
Larutan Formaldehid
Larutan tripsin
Aquades

Tabel Hasil Pengamatan

No
1

Prosedur Kerja
Disiapkan 100 mL larutan
gelatin

Hasil Pengamatan
- Gelatin berupa serbuk berwarna putih
kekuningan
- NaOH adalah larutan bening tak berwarna

10
11

12

- Indikator fenolftalein berwarna putih keruh

- Larutan gelatin berwarna kuning kecoklatan
Sebanyak 110 tetes larutan NaOH ditambahkan
sampai terbentuk larutan berwarna merah muda

Ditambahkan ke dalamnya 1
mL fenol ftalein dan larutan
NaOH 0,2 M tetes demi tetes
sampai larutan berubah
warnanya menjadi merah muda
Sebanyak 0,1 M HCl
Sebanyak 175 tetes larutan HCl ditambahkan
ditambahkan tetes demi tetes
ke dalam larutan sampai warna larutan kembali
sampai teoat warna merah
bening kekuningan dengan pH sebesar 8,11
muda hilang (pH= 8,0 )
Larutan gelatin yang telah
Larutan direndam dalam incubator air pada
dinetralisir direndam dalam
suhu 38oC
incubator air pada suhu 38oC
Pada Tabung lain, sebanyak 25 - Tripsin adalah serbuk berwarna putih
mL larutan tripsin ditambahkan - Larutan tripsin berwarna putih keruh
3 tetes fenolftalein dan tetes - Setelah diteteskan 53 tetes NaOH larutan
menjadi berwarna merah muda
demi tetes larutan NaOH 0,2 M
sampai warnanya berubah
menjadi merah muda
Larutan HCl 0,1 M diteteskan
Larutan ditambahkan 85 tetes HCl sehingga
sampai warna merah muda
warna merah mudanya hilang dengan pH
hilang (pH= 8,00)
sebesar 8,02
Campuran tersebut diinkubasi
Larutan direndam dalam incubator air pada
dalam incubator air pada suhu
suhu 38oC
38o C selama beberapa menit
Larutan tripsin ditambahkan ke Setelah kedua larutan tersebut dicampur ,
dalam larutan gelatin, dan
larutan menjadi berwarna kuning keruh
diaduk perlahan
Setelah tercampur merata,
Diambil campuran sebanyak 10 mL
diambil 10 mL campuran dan
dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer 100 mL (control
/waktu 0 menit )
Dididihkan (untuk merusak
Campuran dididihkan selam 3 menit dan warna
enzim) selanjutnya didinginkan tetap kuning keruh
Sebanyak 15 mL formalin
Setelah campuran ditambahkan formalin dan
netral dan 3 tetes fenolftalein
indikator pp warna larutan tetap kuning keruh
ditambahkan ke dalam
campuran tersebut
Pada interval waktu
Setelah dititrasi dengan NaOH 0,02 M warna
15,30,45,60,90 dan 120 menit
larutan menjadi merah muda. Adapun Volume

dari waktu ke nol dilakukan hal

yang sama seperti pada kontrol.
Pada masing- masing reaksi
diatas, dilakukan titrasi dengan
0,02 M larutan NaOH sampai
titik akhir warna merah muda

V.

NaOH yang diperlukan

No
1
2
3
4
5
6
7

Waktu (menit)
Kontrol (0)
15
30
45
60
90
120

Volume NaOH (mL)

14,2
16,6
17,3
18,5
21,0
22,0
23,3

Analisis Data dan Pembahasan

ANALISIS DATA
1. Kurva titrasi asam amino yang dinyatakan dengan hubungan volume NaOH terhadap
waktu
Berdasarkan hasil praktikum diperoleh data hasil titrasi asam amino dengan menggunakan
NaOH sebagai titran yaitu sebagai berikut.
Tabel 1. Hasil titrasi asam amino dengan menggunakan NaOH sebagai titran
Waktu (menit)

Volume (mL)

0
14,2
15
16,6
30
17,3
45
18,5
60
21,00
90
22,00
120
23,3
Berdasarkan data di atas, maka dapat dibuat kurva titrasi hubungan volume NaOH terhadap
waktu sebagai berikut.

Kurva Titrasi Hubungan Volume NaOH Terhadap Waktu

35
30
Hubungan volume NaOH terhadap waktu
25
f(x) = 0.07x + 15.15
20
R = 0.94
Volume NaOH (mL) 15
10
Linear (Hubungan volume NaOH terhadap waktu)
5
0
0

20

40

60

80

100

120

140

Waktu (menit)

Gambar 1. Kurva Hubungan Volume NaOH terhadap Waktu

Berdasarkan kurva tersebut diatas, maka dapat dihitung derajat hidrolisis dari enzim tripsin
terhadap larutan gelatin melalui perhitungan sebagai berikut.
Derajat h idrolisis=

V NaOH
t

????
2. Penentuan Jumlah Mg Asam Amino pada Tiap Volume NaOH saat Titrasi
Dengan mengasumsikan 1 mL NaOH ekivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka
dapat dihitung jumlah mg asam amino pada tiap volume NaOH saat titrasi. Adapun
perhitungannya yaitu sebagai berikut.
Pada waktu t = 0
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 14,2 mL
Mol NaOH = 14,2 mL x 0,02 M = 0,284 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,284 mmol
NaOH ekuivalen dengan:

0,1 mmol
1,4 mg
=
0,284 mmol x mg
x=

0,284 mmol 1,4 mg

=3,976 mg nitrogenasam amino
0,1 mmol

Pada waktu t = 15
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 16.6 mL
Mol NaOH = 16,6 mL x 0,02 M = 0,332 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,332 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1mmol
1,4 mg
=
0,332mmol
x mg
x=

0,332mmol 1,4 mg
=4,648 mg nitrogenasam amino
0,1mmol

Pada waktu t = 30
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 17,3 mL
Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,346 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,346 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1mmol
1,4 mg
=
0,346 mmol x mg
x=

0,346 mmol 1,4 mg

=4,844 mgnitrogen asamamino
0,1 mmol

Pada waktu t = 45
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 18,5 mL
Mol NaOH = 8,6 mL x 0,02 M = 0,37 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,37 mmol
NaOH ekuivalen dengan:

0,1mmol 1,4 mg
=
0,37 mmol x mg
x=

0,37 mmol 1,4 mg

=5,18 mgnitrogen asam amino
0,1 mmol

Pada waktu t = 60
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 8,95 mL
Mol NaOH = 8,95 mL x 0,02 M = 0,42mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,42 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1mmol 1,4 mg
=
0,42mmol
x mg
x=

0,42mmol 1,4 mg
=5,88 mg nitrogen asamamino
0,1 mmol

Pada waktu t = 90
Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 22 mL
Mol NaOH = 22 mL x 0,02 M = 0,44 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,44 mmol
NaOH ekuivalen dengan:
0,1 mmol 1,4 mg
=
0,44 mmol x mg
x=

0,44 mmol 1,4 mg

=6,16 mg nitrogenasam amino
0,1 mmol

Pada waktu t = 120

Volume NaOH 0,02 M yang digunakan = 23,3 mL
Mol NaOH = 23,3 mL x 0,02 M = 0,466 mmol
1 mL NaOH 0,1 N ekuivalen dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, sehingga untuk 0,466 mmol
NaOH ekuivalen dengan:

0,1mmol
1,4 mg
=
0,466 mmol x mg
x=

0,466 mmol 1,4 mg

=6,524 mg nitrogenasam amino
0,1 mmol

Tabel 2. mg Nitrogen asam amino yang diperoleh dari hasil titrasi

Waktu (menit)

Volume (mL)

mg

Nitrogen

asam amino
0
14,2
3,976
15
16,6
4,648
30
17,3
4,844
45
18,5
5,18
60
21,00
5,88
90
22,00
6,16
120
23,3
6,524
Berdasarkan data diatas, maka dapat dibuat kurva hubungan antara mg nitrogen asam
amino terhadap waktu yaitu sebagai berikut. (kurva blm)
Gambar 2. Kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam percobaan ini, dilakukan titrasi formal asam amino. Titrasi formal asam amino
merupakan titrasi asam amino atau campuran asam amino dalam keberadaan formaldehida.
Asam amino yang digunakan merupakan hasil degradasi dari gelatin (polipeptida) yang
didegradasi menggunakan enzim protease yaitu tripsin. Adapun prinsip dari percobaan ini
mengikuti kenyataan bahwa suatu protein mengikuti teori zwitter ion, dimana suatu asam amino
walaupun memiliki dua sisi aktif (gugus COOH dan gugus amina NH 2), sehingga dapat
dititrasi menggunakan asam dan basa. Namun kenyataannya, gugus ammonium dari asam amino
merupakan buffer pada pH tinggi (di atas pH 11) sehingga tidak mungkin untuk mentitrasinya
pada titik akhir suatu indikator. Hal ini mengingat dimana suatu indikator pada umumnya
memiliki trayek pH sedapat mungkin mendekati pH 7 karena titrasi asam basa merupakan suatu
reaksi penetralan. Dalam percobaan ini, reagen yang digunakan adalah larutan gelatin. Gelatin
merupakan polipeptida (protein) yang larut dalam air, hal ini terbukti dengan mudah larutnya
gelatin ketika ditambahkan ke dalam aquades. Gelatin merupakan gelting agent (bahan pembuat
gel), sehingga perlu diinkubasi pada suhu 38 oC. Bila suhu inkubasi diatas 38oC, maka
kemungkinan akan terbentuk gel yang akan mempengaruhi proses degradasi untuk menghasilkan
asam amino.

Sebelum dilakukan proses titrasi dalam percobaan ini terlebih dahulu dilakukan proses
pembuatan larutan gelatin dengan cara melarutkan 5 gram padatan gelatin ke dalam 100 mL
aquades. Setelah dilarutkan dan diaduk terbentuk larutan gelatin yang berwarna kuning.
Larutan gelatin ini kemudian ditambahkan indikator fenolftalein sebanyak 1 mL dan
ditambahkan larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sehingga larutan gelatin berwarna merah
muda. Adapun tujuan penambahan NaOH adalah agar larutan bersifat sedikit basa.
Larutan yang berwarna merah ini kemudian ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi
tetes. Penambahan larutan HCl menyebabkan warna larutan kembali berwarna kuning.
Penambahan larutan HCl bertujuan agar pH menjadi 8 dimana pada pH ini enzim tripsin akan
mampu bekerja secara optimal. Dalam percobaan ini diperoleh pH setelah penambahan HCl
yaitu 8,02. Hal yang sama juga dilakukan terhadap enzim tripsin, dimana dilakukan penambahan
fenolftalein dan NaOH kedalam 25 mL larutan tripsin sehingga warna menjadi merah muda.
Kemudian larutan ini ditambahkan larutan HCl 0,1 M tetes demi tetes hingga warna merah muda
akibat penambahan fenolftalein dan NaOH ini hilang. Hal ini dilakukan agar kondisi enzim
tripsin sama dengan kondisi gelatin sehingga saat direaksikan akan terjadi reaksi yang sempurna.
Setelah itu, larutan gelatin dan tripsin ini diinkubasi dengan inkubator air pada suhu 38 oC,
dimana suhu ini dijaga supaya tidak melebihi suhu 38 oC karena dapat menyebabkan enzim rusak
yang ditandai dengan pembentukan gel yang sangat mempengaruhi proses degradasi
menghasilkan asam amino. Setelah diinkubasi selama beberapa menit, kedua larutan ini
kemudian dicampur. Dari pencampuran ini terbentuk larutan berwarna kuning kecoklatan.
Tujuan pencamuran ini adalah untuk mengdegradasi larutan gelatin dengan menggunakan enzim
tripsin. Tripsin merupakan enzim proteolitik yang hanya terdiri dari suatu rantai polipeptida.
Enzim ini akan mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya.
Sebanyak 10 mL dari larutan ini diambil dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan
dilakukan pendidihan terhadap larutan ini dengan tujuan untuk merusak enzim. Kemudian
dilakukan pendinginan terhadap larutan. Setelah dingin, larutan ditambahkan 15 mL larutan
formaldehid dan 3 tetes fenolftalein. Warna larutan setelah ditambahkan formaldehid dan
fenolftalein yaitu tetap berwarna kuning keruh. Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan
NaOH 0,02 M. Titrasi dihentikan ketika larutan ini berubah warna menjadi merah muda.
Adapun penambahan formaldehid sebelum titrasi berfungsi agar gugus karbonilnya
bereaksi dengan asam amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium
bereaksi dengan NaOH dan membuffer pada pH yang lebih rendah serta dapat dititrasi pada titik
akhir secara kuantitatif menggunakan suatu indikator. Reaksi yang terjadi pada titrasi dengan
menggunakan formalin merupakan reaksi pembentukan dimetilol. Larutan protein yang telah
dinetralkan dengan basa (NaOH), ditambahkan formalin sehingga membentuk dimetilol. Dengan
terbentuknya dimetilol ini, berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi
reaksi yang terjadi antara gugus asam (karboksil) dengan basa (NaOH) sehingga titik akhir titrasi
dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein. Bila titik akhir titrasi
diperoleh tepat, maka akan terjadi perubahan warna larutan dari bening menjadi merah muda.
Reaksi yang terjadi dalam proses ini adalah sebagai berikut :
H
R

C
NH2

H
COOH

NaOH

C
NH3+

COO -

H
R

O
COO- +

C
NH3+

C
H

COOH

CH2OH

H
O
C
H

H
R

COOH

HOH2C

CH2OH

dimethilol

COOH + NaOH

HOH2C

CH2OH

COO-Na+ + H 2O

HOH2C

CH2OH

Berdasarkan Kurva hubungan volume NaOH terhadap waktu di atas, dapat diketahui
bahwa semakin lama larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang digunakan
untuk proses titrasi. Hal ini terjadi karena selama proses hidrolisis gelatin oleh tripsin
menghasilkan sejumlah asam amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan
bertambahnya interaksi antara larutan gelatin dengan larutan tripsin. Enzim tripsin yang semakin
lama menghidrolisis gelatin menyebabkan gugus karboksil dan gugus amino yang dihasilkan
semakin banyak. Dengan bertambahnya gugus ini, maka jumlah NaOH yang digunakan pada
saat titrasi juga bertambah.
Secara kuantitatif dari kurva yang diperoleh, maka dapat dihitung derajat
hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin. Berdasarkan hasil analisis data besar derajat
hidrolisis dari enzim tripsin terhadap larutan gelatin adalah 0,0122 .
Selanjutnya dari kurva hubungan waktu terhadap mg Nitrogen asam amino di atas,
terlihat bahwa semakin lama waktu yang digunakan larutan gelatin untuk bereaksi dengan enzim

pankreatin maka semakin banyak pula mg nitrogen asam amino yang dihasilkan. Terdapat
hubungan yang searah antara waktu kontak dengan mg nitrogen asam amino. Hal ini terjadi
karena selama proses hidrolisis gelatin (protein) oleh enzim pankreatin menghasilkan sejumlah
gugus karboksil dan gugus amino yang bertambah sehingga nitrogen yang terdapat pada
dimethilol juga ikut bertambah.
SIMPULAN
Berdasarkan pembahasan di atas, maka diperoleh beberapa kesimpulan antara lain :
1
2

Protein dapat dihidrolisis dengan enzim protease dan melalui titrasi formal asam amino.
Kurva hubungan antara volume NaOH terhadap waktu dan kurva mg nitrogen asam amino
terhadap waktu pada titrasi formal asam amino berbanding lurus dimana semakin lama
larutan didiamkan, maka semakin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi
larutan asam amino tersebut maka semakin banyak pula mg nitrogen dari asam amino yang
dihasilkan.