Anda di halaman 1dari 21

Laporan Praktikum Biokimia

Percobaan 1
Protein: Reaksi Uji terhadap Asam Amino dan Penentuan Kadar Protein
Secara Lowry

Nama
NIM
Kelompok
Tanggal Percobaan
Tanggal Laporan
Asisten

: Muhamad Gidry Abdurrazak


: 11213016
:4
: 6 Februari 2015
: 20 Februari 2015
: Nurwanti Fatnah / 20514007

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2015

1. Tujuan
a. Menentukan keberadaan asam amino tirosin dan triptofan dalam albumin dan
gelatin menggunakan uji Millon dan Hopkins Cole
b. Menentukan hasil reaksi sistin dengan Pb asetat dan NaOH 1 N
c. Menentukan hasil reaksi sistein dengan reaksi Nitroprussida
d. Menentukan hasil uji Millon (endapan) dan Biuret (larutan filtrat) terhadap protein
albumin setelah diendapkan dalam garam ammonium sulfat dan didekantasi
e. Menentukan pengaruh asam kuat (HCl), basa kuat (NaOH), asam lemah (buffer
asetat pH 4,7) dan suhu tinggi dalam mendenaturasi protein
f. Menentukan kadar protein sampel dengan metode Lowry
2. Prinsip Percobaan
Asam amino adalah molekul organik dengan massa molekul kecil yang
mengandung paling sedikit satu gugus karboksil dan satu gugus amino. Berdasarkan
sifat rantai sampingnya (rantai R), asam amino dibagi menjadi tujuh kelompok:
alifatik, aromatik, hidroksilik, karboksilik, mengandung sulfur (S), imino, amino, dan
amida. Rantai samping inilah yang dapat dimanfaatkan dalam analisis kandungan
protein melalui berbagai uji, seperti Millon dan Hopkins - Cole.
Uji Millon menggunakan reagen yang terdiri dari larutan merkuri dan ion
merkuro dalam larutan asam nitrat. Uji Millon adalah uji spesifik untuk tirosin (Milio
dan Loffredo, 1995:4). Uji Millon akan menghasilkan warna merah apabila terdapat
tirosin dalam protein yang diuji. Warna merah ini adalah garam merkuri dari tirosin
yang ternitrasi.
Uji Hopkins Cole menggunakan reagen yang mengandung asam glioksilat
(CHO-COOH). Uji ini spesifik untuk asam amino triptofan (Milio dan Loffredo,
1995:4). Triptofan dapat berkondensasi dengan aldehid pada asam glioksilat dalam
asam sulfat dan menghasilkan warna Violet.
Sistin adalah asam amino yang mengandung sulfur dan terbentuk dari 2 asam
amino sistein. Apabila asam amino yang mengandung sulfur bereaksi dengan Pb
asetat, akan terbentuk endapan hitam.
Reaksi Nitroprussida adalah reaksi yang digunakan untuk menentukan
keberadaan asam amino sistein yang mengandung gugus sulfhidril (-SH) (Milio dan
Loffredo, 1995:4). Gugus sulfuhidril akan bereaksi dengan nitroprussida dalam
suasana ammonia berlebih membentuk kompleks berwarna merah.
Protein dapat mengendap akibat mengandung garam-garam anorganik dalam
konsentrasi tinggi, seperti ammonium sulfat, magnesium sulfat, dan natrium klorida
(Aboazma, 2013:5). Hal ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi
sehingga berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air. Dengan demikian,
kelarutan protein pun akan berkurang. Namun bila protein diendapkan dengan garamgaram anorganik berikut tanpa perlakuan khusus seperti diaduk dengan magnetic
stirrer dengan kecepatan konstan, protein yang ingin diendapkan dapat mengalami
denaturasi (Sari, 2012)
Protein dapat mengalami kerusakan struktur yang disebut dengan denaturasi.
Protein yang terdenaturasi akan kehilangan sifat alaminya, sehingga protein-protein

tertentu seperti enzim akan kehilangan fungsinya. Faktor-faktor yang dapat


menyebabkan protein terdenaturasi diantaranya interaksi dengan senyawa asam atau
basa, suhu tinggi, dan pelarut organik.
Denaturasi dapat diartikan sebagai perubahan atau modifikasi terhadap
struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein, tanpa terjadinya
pemecahan ikatan-ikatan
kovalen. Karena itu denaturasi dapat pula
dikatakan
sebagai suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen interaksi
hidrofobik, ikatan
garam, dan terbentuknya lipatan atau wiru molekul
(Winarno,
1992; Triyono, 2010:3).
Ada beberapa metode untuk menentukan konsentrasi protein, salah satunya
adalah metode Lowry. Metode Lowy pada awalnya hanya menggunakan satu reagen,
yakni Folin-Ciocalteu. Namun pada perkembangannya, sensitifitas reagen ini
mengalami peningkatan apabila digabungkan dengan reagen Biuret. Setelah protein
diberi kedua reagen, absorbansi dari campuran protein-reagen yang sudah diinkubasi
supaya bereaksi sempurna dicek pada spektrofotometer dengan panjang gelombang
700 nanometer.
3. Prosedur Kerja
3.1 Uji Millon
Dua buah tabung reaksi diisi dengan 2% gelatin sebanyak 2 mL pada salah
satu tabung, dan larutan albumin putih telur sebanyak 2 mL pada tabung lainnya.
Kedua tabung diberi label sesuai larutan yang dikandungnya. Kedua tabung tersebut
kemudian ditambahkan tiga tetes reagen Millon, setelah itu dipanaskan dengan cara
menempatkan kedua tabung pada gelas kimia berisi air mendidih di atas penangas air.
Kemudian hasil reaksi diamati dan dicatat. Larutan yang telah bereaksi dibuang ke
dalam wadah berlabelkan Discharded Millons solutions. Kemudian tabung dicuci
sampai bersih.
3.2 Uji Hopkins-Cole
Dua buah reaksi diisi dengan 2% gelatin sebanyak 2 mL pada salah satu
tabung, dan larutan albumin putih telur sebanyak 2 mL pada tabung lainnya. Kedua
tabung diberi label sesuai larutan yang dikandungnya. Kemudian seteah itu kedua
tabung diberi reagen Hpokins Cole sebanyak 2 mL. Kedua tabung kemudian
ditambahkan 30 tetes asam sulfat pekat melalui dinding tabung dengan memiringkan
tabung dengan sudut 450. Kemudian hasil reaksi diamati dan dicatat. Larutan yang
telah bereaksi dibuang ke dalam wadah berlabelkan Discharded Hopkins-Cole
solutions. Kemudian tabung dicuci sampai bersih.

3.3 Uji Sistin

Tabung reaksi diisi dengan sedikit sistin, dan dilarutkan dalam 5 mL NaOH 1
N. Larutan tersebut ditambahkan sedikit kristal Pb-asetat. Tabung reaksi tersebut
dipanaskan dengan cara menempatkan tabung pada gelas kimia berisikan air yang
telah mendidih.
3.4 Uji Sistein
Tabung reaksi diisi dengan kristal sistein hidroksida dan dilarutkan dalam 5
mL air. Larutan tersebut ditambahkan 0,5 mL larutan nitroprusida 1%, dan 0,5 mL
NH4OH.
3.5 Pengendapan Garam
Satu tabung reaksi diisi dengan 5 mL larutan albumin telur (1:5) dengan garam
amonium sulfat serta aduk larutan hingga garam melarut. Larutan diisi lagi dengan
garam amonium sulfat, dan diaduk sampai garam mengendap. Jika garam belum
mengendap, ulangi terus langkah sebelumnya. Larutan yang telah jenuh disaring
sehingga didapat endapan dan filtrat. Endapan diuji dengan reagen Millon dan filtrat
diuji dengan reagen biuret.
3.6 Denaturasi Protein
Tiga tabung disiapkan dan diberi nomor 1, 2, dan 3. Ketiga tabung diisi
dengan larutan albumin seanyak 9 mL. Tabung 1 ditambahkan 1 mL HCL 0,1 M,
tabung 2 ditambahkan NaOH 0,1 M, dan Tabung 3 ditambahkan 1 mL bufer asetat
dengan 1 M pH 4,71. Ketiga tabung dipanaskan pada gelas kimia berisi air mendidih
diatas penangas air. Hasilnya diamati dan dicatat. Tabung 1 dan 2 ditambahkan 10 mL
bufer asetat dengan pH 4,7. Hasil yang didapat diamati dan dicatat.
3.7 Penentuan Kadar Protein Secara Lowry
Tujuh tabung reaksi disiapkan dan diberi label 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan 7. Tabung 1
diisi dengan aquades sebanyak 0,5 mL; tabung 2 diisi 0,1 mL larutan BSA standar
ditambah aquades sebanyak 0,4 mL; tabung 3 diisi 0,2 mL larutan BSA standar
ditambah aquades sebanyak 0,3 mL; tabung 4 diisi 0,3 mL larutan BSA standar
ditambah aquades sebanyak 0,2 mL; tabung 5 diisi 0,4 mL larutan BSA standar
ditambahkan aquades sebanyak 0,1 mL. Tabung 6 dan 7 diisi 0,5 larutan sampel
protein. Seluruh pengisian larutan dilakukan menggunakan pipet berukuran 1 mL.
Kemudian seluruh tabung diisi dengan reagen Biuret sebanyak 2 mL. Tiap tabung
diinkubasi tepat selama 10 menit dimulai dari penambahan larutan Biuret. Setelah 10
menit, seluruh tabung ditambahkan 0,2 mL reagen Folin-Ciocalteu, dan dikocok
menggunakan vortex. Setelah itu seluruh tabung diinkubasi selama 30 menit pada
suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer
dengan panjang gelombang 700 nm. Larutan tabung 1 dimasukkan kedalam kuvet
untuk kemudian dimasukkan kedalam spektrofotometer. Tombol kalibrasi pada alat
spektrofotometer kemudian ditekan agar larutan pada tabung 1 menjadi acuan seluruh
tabung (blanko). Pengukuran absorbansi larutan tabung 2 sampai 8 dilakukan dengan
cara membilas kuvet terlebih dahulu dengan aquades dan dengan larutan yang akan

diukur secara bergantian. Kemudian kuvet dimasukkan larutan yang akan diukur,
selanjutnya kuvet dibersihkan dengan tisu di bagian yang tidak boleh dipegang tangan
sebelum dimasukkan kedalam spektrofotometer. Pengukuran absorbansi larutan
dilakukan satu per satu. Hasil pengukuran dicatat.
4. Data Pengamatan
4.1 Uji Kualitatif
a. Uji Millon
Protein
Albumin

Gelatin 2%

Sebelum diberi reagen Setelah diberi reagen


Millon + pemanasan
Millon + pemanasan
Putih keruh
Terbentuk
endapan
merah

Bening

b. Uji Hopkins Cole


Protein
Sebelum diberi reagen
Hopkins - Cole +
H2SO4 pekat
Albumin
Putih keruh

Gelatin 2%

Bening

Terbentuk
merah

endapan

Setelah diberi reagen


Hopkins - Cole + H2SO4
pekat
Terbentuk cincin ungu

Bening

c. Sistin
Campuran
Sebelum dipanaskan
yang diuji
Sistin + 5 ml Kehitaman
NaOH 1 N +
Pb - asetat

Setelah dipanaskan
Terdapat endapan hitam

d. Sistein
Asam amino Sebelum diberi reagen
yang diujikan
Kristal Sistein Bening
+ 5 mL air

Setelah diberi reagen


nitroprussida + NH4OH
Terbentuk warna merah

e. Pengendapan Albumin oleh Garam


Hasil Filtrasi
Uji Millon
Endapan
Terdapat warna merah

Larutan filtrat

Hasil Pengujian
Uji Biuret
-

Tidak berubah

f. Denaturasi Protein
Tabung (Zat)
Karakteristik
Sebelum dipanaskan
Setelah dipanaskan ( +
ditambahkan
buffer
asetat pH 4,7 untuk
tabung 1 dan 2)
1 (Albumin Berwarna putih susu
+ HCl 0,1
M)

Terdapat endapan
gumpalan putih

2 (Albumin Berwarna putih susu


+ NaOH 0,1
M)

Terdapat endapan putih

3 (Albumin Berwarna putih susu


+
buffer
asetat
pH
4,7)

Endapan putih

4.2 Uji Kuantitatif dengan Lowry


a. Rumus penentuan konsentrasi protein BSA dalam tabung:

V1 M1 = V2 M2
Keterangan:
V1 : Volume BSA stok yang ditambahkan (dalam mL)
M1 : Konsentrasi BSA stok yang ditambahkan (dalam g/mL)
V2 : Volume larutan pada tabung (dalam mL)
M2 : Konsentrasi BSA dalam larutan pada tabung (dalam g/mL)

Untuk tabung 1
M2 = 0 (tidak ada BSA yang ditambahkan)
Untuk tabung 2
0,1 x 200 = 0,5 x M2
M2 = 40
Untuk tabung 3
0,2 x 200 = 0,5 x M2
M2 = 80
Untuk tabung 4
0,3 x 200 = 0,5 x M2
M2 = 120
Untuk tabung 5
0,4 x 200 = 0,5 x M2
M2 = 160

b. Komposisi Larutan dalam tiap tabung


Penambahan (ml)
Standar BSA (g/ml)
Sampel protein
H2O
Reagen Biuret
Reagen Fenol
Absorbansi

1
0,5
2
0,2
0,000

2
0,1
0,4
2
0,2
0,022

Nomor Tabung
3
4
5
0,2
0,3
0,4
0,3
0,2
0,1
2
2
2
0,2
0,2
0,2
0,031
0,037
0,051

c. Kurva Standar BSA (A700 vs Konsentrasi) dan Persamaan Kurva

6
0,5
2
0,2
0,023

7
0,5
2
0,2
0,02

0.06
0.05
0.04
Absorbansi 0.03
0.02
0.01
0
0 20 40 60 80 100120140160180
Konsentrasi ( gram/mL)

y = 4,8 10-3 + 2,925 10-4x


d. Konsentrasi Protein Sampel
Absorbansi sampel (ys) = 0,0225
Konsentrasi sampel (xs) :
(0,0225) = 4,8 10-3 + 2,925 10-4xs
xs = 60,51 g / mL

5. Pembahasan
5.1 Uji Kualitatif
a. Uji Millon
Uji Millon digunakan untuk mendeteksi adanya gugus hidroksi fenolik
pada suatu protein. Pereaksi Millon terdiri atas larutan merkuri (Hg) dalam
HNO3 atau asam nitrat. Apabila uji Millon positif, akan terbentuk endapan
garam merkuri berwarna putih yang bila dipanaskan akan berwarna merah.
Apabila uji Millon dilakukan terhadap asam amino tirosin, terbentuk
endapan merah kecoklatan setelah dipanaskan. Hal ini dikarenakan gugus
fenol pada tirosin bereaksi dengan merkuri dari reagen Millon membentuk
kompleks merkuri. Tirosin sendiri merupakan asam amino yang mengandung
gugus fenol (Nelson dan Cox, 2008:870). Dengan demikian, protein yang
mengandung asam amino tirosin akan menghasilkan hasil positif apabila diuji
oleh reagen Millon Adapun struktur dari tirosin ditunjukkan pada Gambar 4.1

Gambar 4.1 Struktur Tirosin

Sedangkan reaksi dari reagen Millon terhadap senyawa yang


mengandung gugus fenol ditunjukkan pada Gambar 4.2

Gambar 4.2 Reaksi reagen Millon terhadap senyawa dengan gugus fenol

Gelatin mengandung asam amino yang memiliki gugus fenol, yakni


tirosin. Hal ini terbukti karena saat ditambahkan reagen Millon dan
dipanaskan gelatin membentuk endapan merah kecoklatan. Menurut Lewis
dkk. (1950:27), albumin juga mengandung tirosin sebagai penyusunnya.
Dengan demikian hasil uji Millon pada albumin pun akan positif mengandung
endapan merah kecokatan.

Gambar 4.3 Kandungan asam amino pada gelatin (dikutip dari www.pbgelatins.com)

b. Uji Hopkins - Cole


Uji Hopkins-Cole merupakan uji untuk menentukan inti indol pada
asam amino. Indol adalah struktur kimia berupa cincin benzen yang terikat
pada ikatan C-2 dan C-3 dari pirol (Hart dkk., 2010: 403). Uji Hopkins Cole

menggunakan senyawa aldehid seperti asam glioksilat. Reaksi positif adanya


inti indol asam amino pada uji Hopkins Cole ditandai dengan terbentuknya
cincin berwarna ungu / violet pada sampel percobaan. Reagen Hopkins-Cole
mengkondensasi inti indol dengan asam glioksilat dengan bantuan asam kuat
seperti asam sulfat, sehingga terbentuk 2 fasa dengan cincin ungu yang
terletak pada permukaan bidang batas kedua fasa tersebut.
Asam amino yang memiliki inti indol adalah triptofan. Protein yang
mengandung inti indol adalah protein dengan triptofan sebagai salah satu asam
amino penyusunnya. Protein dengan karakteristik tersebut akan memberikan
hasil positif dengan uji Hopkins Cole. Adapun persamaan reaksi dari uji
Hopkins Cole dengan triptofan ditunjukkan dengan Gambar 4.4

Gambar 4.4 Persamaan reaksi uji Hopkins Cole dengan triptofan

Uji protein albumin dengan Hopkins Cole pada percobaan ini


menghasilkan lapisan cincin ungu antara 2 fasa yang terbentuk. Hal ini
menunjukkan bahwa albumin mengandung inti indol berupa triptofan. Hal ini
sesuai dengan literatur (Lewis dkk., 1950: 27). Uji protein gelatin dengan
Hopkins Cole tidak menghasilkan perubahan apapun. Hal ini menunjukkan
bahwa gelatin tidak mengandung inti indol seperti pada albumin. Adapun
kandungan asam amino gelatin dapat dilihat pada Gambar 4.3.
c. Uji Sulfur pada sistin
Uji yang dilakukan pada sistin dalam percobaan kali ini adalah uji
sulfur. Uji ini dapat dilakukan dengan menambahkan basa kuat yang disusul
dengan timbal asetat pada sampel protein. Fungsi basa kuat sendiri adalah
untuk melepaskan sulfur yang dikandung protein menjadi ion sulfida.
Sedangkan timbal asetat diberikan agar timbal bereaksi dengan ion sulfida. Uji
sulfur positif apabila terbentuk endapat timbal sulfida (PbS) yang berwarna
kehitaman. Sistin sendiri sebenarnya terbentuk dari 2 molekul asam amino
sistein dengan reaksi jembatan disulfida.
Uji sulfur yang dilakukan pada sistin dalam percobaan kali ini
menghasilkan warna kehitaman dan endapan berwarna kehitaman setelah
dipanaskan. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa sistin
memang mengandung sulfur (Butz dan du Vigneaud, 1932: 136). Sistin sendiri
terbentuk dari dua molekul asam amino sistein yang terhubung dengan
jembatan disulfida.

Gambar 4.5 Reaksi pembentukan sistin dari 2 molekul sistein

d. Uji Nitroprussida pada sistein


Uji yang dilakukan pada sistein dalam percobaan kali ini adalah uji
Nitroprussida dengan reagen nitroprussida 1 % dan NH 4OH. Fungsi dari
NH4OH adalah sumber NH4+ sebagai kation untuk kompleks merah yang akan
terbentuk menggantikan ion natrium dari reagen nitroprussida. Ion
nitroprussida sendiri akan berikatan pada asam amino yang mengandung
gugus sulfhidril dengan mensubstitusi hidrogen pada gugus sulfhidril tersebut.
Reaksi nitroprussida secara umum dapat dituliskan seperti pada Gambar 4.6
[Fe3+(CN)5NO]2- + NH3 + RSH NH4+ + [Fe2+ (CN3NOSR]2
Warna salmon

Warna merah

Gambar 4.6 Reaksi Nitroprussida

Reaksi Nitroprussida yang dilakukan pada sistein yang dilakukan pada


percobaan kali ini menghasilkan warna merah. Hal ini sesuai dengan literatur
yang menunjukkan kalau sistein memang memiliki gugus sulfhidril bebas
(Junaidi, 2008). Adapun struktur kimia dari sistein dapat dilihat di Gambar 4.5
sebelumnya.
e. Pengendapan albumin oleh garam
Percobaan pengendapan protein albumin oleh garam pada praktikum
ini menggunakan garam ammonium sulfat. Garam ammonium sulfat sendiri
merupakan garam anorganik dengan kelarutan yang tinggi, kekuatan ionik
besar, namun tidak menyebabkan denaturasi ireversibel pada protein seperti
garam-garam logam berat. Penjenuhan larutan protein albumin dengan
penambahan ammonium sulfat pada percobaan ini menyebabkan pengendapan
protein albumin. Hal ini disebabkan oleh persaingan antara protein albumin
dan ammonium sulfat dalam berikatan dengan molekul air. Persaingan dengan
garam ammonium sulfat ini akan membuat kelarutan protein makin berkurang
(mengalami dehidrasi). Sebagai akibatnya, interaksi antarmolekul protein
menjadi lebih kuat daripada interaksi antara pelarut (air) dan zat terlarut
(protein albumin). Hal ini menyebabkan molekul-molekul protein mengental
dengan membentuk interaksi hidrofobik antara satu dengan lainnya (salting-

out). Interaksi ini ini terjadi secara maksimal apabila protein berada pada titik
isoelektriknya. Menurut Triyono (2010: 5), Pada titik isoelektrik protein akan
berikatan antara muatannya sendiri membentuk lipatan ke dalam sehingga
terjadi pengendapan yang relatif cepat.
Kemudian setelah larutan didekantasi, endapan diuji menggunakan
reagen Millon. Uji Millon pada endapan memberikan hasil positif dengan
terbentuknya warna merah pada endapan setelah ditambah reagen Millon.
Dengan demikian, terbukti bahwa endapan tersebut adalah protein albumin.
Hal ini didasarkan pada hasil percobaan uji Millon yang dilakukan
sebelumnya yang menyatakan bahwa albumin akan menghasilkan uji positif
bila diberikan reagen Millon.
Larutan filtrat hasil dekantasi kemudian diuji dengan reagen biuret. Uji
biuret sendiri merupakan uji protein untuk mengetahui keberadaan ikatan
peptida pada protein. Uji biuret menggunakan NaOH dan CuSO4 sebagai
reagen. Uji biuret akan positif apabila larutan jadi berwarna ungu akibat
senyawa kompleks yang dibentuk oleh Cu 2+ pada reagen biuret. Hasil uji
biuret terhadap larutan filtrat adalah negatif. Hal ini dimungkinkan terjadi
apabila tidak ada protein pada larutan filtrat, karena ikatan peptida terdapat
pada semua protein (Hart, 2010: 505). Kesimpulan yang dapat ditarik adalah
seluruh protein albumin mengendap dan tersaring pada proses dekantasi. Hal
ini dimungkinkan terjadi apabila larutan sudah sangat jenuh dengan
penambahan ammonium sulfat sehingga seluruh albumin mengendap.
f. Denaturasi Protein
Percobaan denaturasi protein ini menggunakan penambahan asam kuat
HCl 0,1 M, basa kuat NaOH 0,1 M, dan asam lemah buffer asetat dengan pH
4,7 1 M pada 3 tabung berbeda yang diisi oleh protein albumin. Selain itu
digunakan juga pemanasan. Pada tabung reaksi yang berisi albumin dan
ditambah HCl, larutan berubah warna menjadi putih susu. Hal yang yang sama
juga terjadi pada tabung berisi protein yang ditambahkan dengan NaOH 0,1 M
dan buffer asetat pH 4,7. Ketiganya menunjukkan peristiwa yang mirip, yakni
denaturasi protein.
Pada tabung dengan penambahan HCl yang terjadi adalah denaturasi
protein akibat terputusnya ikatan elektrostatik pada jembatan garam yang
membentuk struktur tersier albumin. Ion H+ dari HCl akan bereaksi dengan
gugus -COO- pada salah satu asam amino penyokong jembatan garam dan ion
klor akan menyerang gugus -NH3+ pada asam amino satunya. Hal inilah yang
menyebabkan ikatan jembatan garam pada protein putus dan merusak struktur
tersier protein. Adapun reaksi pemutusan jembatan garam protein oleh HCl
diilustrasikan pada Gambar 4.7

Gambar 4.7 Reaksi pemutusan jembatan garam protein oleh HCl

Pada tabung dengan penambahan NaOH yang terjadi kurang lebih


mirip dengan denaturasi protein yang disebabkan HCl, yakni dengan
terputusnya jembatan garam. Perbedaannya adalah ion OH- dari NaOH akan
bereaksi dengan gugus -NH3+ pada salah satu asam amino penyokong
jembatan garam dan ion Na akan menyerang gugus -COO - pada asam amino
satunya.
Pada tabung dengan penambahan buffer asetat pH 4,7 yang terjadi
mirip dengan denaturasi protein pada tabung dengan penambahan HCl. Ion H +
menyerang gugus -COO- pada satu asam amino penyokong jembatan garam
dan ion CH3COO- menyerang gugus -NH3+ Hanya saja karena buffer asetat
merupakan asam lemah, maka buffer asetat hanya terionisasi sebagian.
Sehingga perusakan jembatan garam yang dilakukan oleh buffer asetat tidak
sebanyak HCl. Hal ini memungkinkan keberadaan protein albumin yang
belum terdenaturasi menjadi lebih besar.
Langkah selanjutnya adalah memanaskan tabung berisi protein yang
sudah diberi asam kuat, basa kuat maupun buffer asetat dengan pH 4,7 di
penangas air. Setelah 15 menit, ketiga tabung didinginkan pada suhu ruang.
Pemanasan sendiri dilakukan untuk mempercepat denaturasi. Hal ini
dimungkinkan terjadi karena panas dapat digunakan untuk mengacaukan
ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar dengan cara menaikkan
energi kinetik molekul penyusun protein. Akibatnya, molekul penyusun
protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan
molekul tersebut. Selain itu, pemanasan juga dilakukan untuk memicu
koagulasi. Protein yang dipanaskan pada suhu 50 0C dapat mengalami
koagulasi (Ningtyas:2012).
Koagulasi adalah suatu keadaan dimana protein tidak lagi
terdispersi sebagai suatu koloid karena unit ikatan yang terbentuk

cukup banyak. Koagulasi dapat juga diartikan sebagai salah satu


kerusakan protein yang terjadi akibat pemanasan dan terjadi
penggumpalan serta pengerasan pada protein karena menyerap air pada
proses tersebut (Makfoeld,2008; Ningtyas, 2012)
Pada pemanasan kepada ketiga tabung setelah ditambahkan masing
masing pereaksi, hanya tabung yang diberi buffer asetat pH 4,7 1 M yang
mengalami koagulasi ketika sudah didinginkan pada suhu kamar. Sedangkan
pada tabung yang ditambahkan HCl dan NaOH harus ditambahkan buffer
asetat pH 4,7 1 M sebanyak 10 mL baru terkoagulasi. Hal ini disebabkan
karena titik isoelektrik albumin sama dengan pH buffer asetat yang digunakan,
yakni 4,7. Titik isoelektrik protein adalah pH dimana muatan total protein
akibat penambahan proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa.
Koagulasi hanya terjadi ketika protein berada di titik isoelektriknya,
sedangkan pada suhu diatas 50 0C pun protein masih dapat larut pada pH di
titik luar isoelektrik tersebut (Purwaningsih,2007; Ningtyas:2012). Larutan
buffer asetat pH 4,7 1 M dalam jumlah relatif banyak pun harus ditambahkan
supaya albumin dapat terkoagulasi pula pada tabung yang ditambah HCl dan
NaOH. Tujuan penambahan buffer tersebut adalah mengubah suasana pH yang
tadinya sangat asam / basa supaya mendekati titik isoelektrik albumin.
5.2 Uji Kuantitatif dengan Lowry
Metode Lowry merupakan metode penentuan kadar protein pada suatu
sampel reagen Folin-Ciocalteu. Sampel yang mengandung asam amino tirosin dan
triptofan akan menghasilkan warna biru yang muncul akibat tungsten dan
molibdenum yang muncul sebagai hasil reduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat
pada reagen Folin Ciocalteu ketika ditambahkan reagen tersebut. Metode Lowry
ini pun dilengkapi dengan penggunaan reagen biuret untuk meningkatkan reduksi
fosfotungstat dan fosfomolibdat. Penambahan ini akan meningkatkan sensitifitas
terhadap spektrofotometer. Absorbansi dari warna-warna yang terbentuk diukur
pada panjang gelombang 700 nm. Metode ini sensitif untuk protein konsentrasi
rendah bila dibandingkan dengan metode biuret semata (Soeharsono, 2006).
Percobaan penentuan kadar protein dengan metode Lowry ini dimulai
denga mempersiapkan larutan standar dengan konsentrasi yang naik secara
berurutan dan dengan rentang yang sempit pada beberapa tabung. Pengaturan
konsentrasi ini dapat dilakukan dengan mengencerkan larutan stok berkonsentrasi
awal relatif besar dibanding yang diinginkan menggunakan air sesuai konsentrasi
protein standar yang diinginkan pada tiap tabung. Tabung yang hanya berisi air
dan protein sampel pun disiapkan. Setiap tabung dikondisikan supaya memiliki
volume larutan yang sama. Kemudian saat ditambahkan reagen biuret, waktu
inkubasi tiap sangat diperhatikan agar tepat 10 menit dengan suhu kamar. Hal ini
dilakukan untuk memastikan larutan protein yang ditambahkan reagen biuret
benar-benar homogen. Setelah itu baru ditambahkan reagen Folin Ciocalteu.
Setelah penambahan reagen ini pun tiap tabung diinkubasi selama 30 menit pada

suhu kamar dengan alasan yang sama dengan inkubasi setelah penambahan biuret.
Setelah melalui prosedur tersebut masing-masing tabung dicek absorbansinya.
Setelah dapat data absorbansi, dibuatlah kurva konsentrasi protein standar
terhadap absorbansi (absis (x): konsentrasi, ordinat (y): absorbansi). Setelah kurva
terbentuk, didapatlah persamaan kurva konsentrasi terhadap absorbansi. Dengan
memasukkan nilai absorbansi protein sampel sebagai nilai ordinat, nilai
konsentrasi protein sampel pun bisa didapat. Protein sampel yang didapat
memiliki absorbansi 0,0225. Dengan persamaan kurva yang didapat: y = 4,810-3
+ 2,92510-4x, didapatkan bahwa konsentrasi protein sampel adalah 60,51 g /
mL.
6. Kesimpulan
a. Dalam albumin dan gelatin, terdapat asam amino tirosin yang mengandung gugus
fenol. Hal ini dapat dibuktikan dengan hasil uji Millon yang positif untuk kedua
protein tersebut
b. Hasil reaksi sistin dengan NaOH 1 N dan Pb-Asetat adalah terbentuknya endapan
kelabu Pb-S akibat putusnya ikatan sulfida pada protein. Putusnya ikatan sulfida
ini disebabkan oleh NaOH 1 N
c. Hasil reaksi Nitroprussida pada sistein adalah terbentuknya warna merah. Warna
merah ini disebabkan oleh natrium nitroprussida yang bereaksi dengan gugus SH
pada sistein
d. Hasil Uji Millon pada endapan yang berhasil disaring dari larutan albumin telur
yang diberi garam ammonium sulfat sampai jenuh adalah positif. Adapun hasil uji
biuret pada larutan filtratnya adalah negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa protein
telah mengendap seluruhnya
e. Hasil percobaan menunjukkan bahwa asam kuat (HCl) , basa kuat (NaOH), dan
asam lemah (buffer asetat pH 4,7) dapat mendenaturasi protein. Selain itu
pemanasan pada protein dapat menyebabkan terjadinya koagulasi.
f. Dari hasil perhitungan dengan persamaan kurva standar, didapatkan konsentrasi
protein sampel sebesar 60,51 g / mL

7. Daftar Pustaka
Aboazma, M. Souad.2013.Protein Chemistry [Power Point Slides].Tersedia:
http://www1.mans.edu.eg/FacMed/english/dept/biochemistry/pdf/PROTEIN.p
df (4 Februari 2015)
Butz, Lewis W. dan Vincent du Vigneaud.1932.The Formation of a Homologue of
Cystine by the Decomposition of Methionine with Sulfuric Acid. Journal of
Biological Chemistry vol 135 (42).
Hart, David J. dkk.2010. Organic Chemistry: a Short Course. Belmont: Brooks/Cole
Cengage Learning.
Junaidi, Eka.2008.Pengaruh Suhu, Ion Klorida dan Ion Sulfida pada Korosi Cu-37Zn
dalam Medium Netral [online]. Tesis Mahasiswa di Digital Library Institut

Teknologi Bandung. Tersedia: http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/ (19


Februari 2015
Lewis, J. C. dkk.1950.Amino Acid Composition of Egg Proteins. Journal of
Biological Chemistry vol. 23 (35).
Milio, Frank R. Dan William M. Loffredo.1995.Qualitative Testing for Amino Acid
and Proteins.Pennsylvania: Chemical Education Resources .Inc
Nelson, David L. dan Michael M. Cox.2008. Lehninger: Principles of Biochemistry.
New York: W.H. Freeman Company.
Ningtyas, Jumiati.2012. Denaturasi, Koagulasi dan proses Browning Non Enzimatis
[makalah online].Tersedia:http://www.academia.edu/8728268/Denaturasi_Koa
gulasi_dan_proses_Browning_Non (19 Fbruari 2015)
Sari, Diah Kartika.2012. Lipase Isolat Lokal pada Sintesis Biodiesel
[online].Tersedia:
http://eprints.unsri.ac.id/195/3/makalah_DiahkartikaUnsri.pdf (11 Februari
2015)
Soeharsono. 2006. Biokimia. Yogyakarta: Gadjah Mada University
Triyono, Agus.2010. Mempelajari Pengaruh Penambahan Beberapa Asam pada
Proses Isolasi Protein terhadap Tepung Protein IsolatKacang Hijau
(Phaseolus
radiatus L.) [online]. Makalah pada Seminar Rekayasa Kimia
dan
Proses
Universitas
Diponegoro
Semarang.
Tersedia:
http://eprints.undip.ac.id/27996/1/C-10.pdf (19
Februari 2015)

Lampiran: Soal dan Jawaban


Soal Uji Millon
Apa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein? Mengapa larutan
albumin terkoagulasi? Larutan protein dengan karakterisasi apa yang akan memberikan uji
negatif? Mengapa?
Jawab:
Apabila garam merkuri ditambahkan ke dalam protein, yang akan terjadi adalah protein akan
terdenaturasi. Karena larutan garam merkuri yang ionik akan merusak jembatan garam pada
protein. Ion merkuri yang bermuatan positif dan pasangannya yang bermuatan negatif (seperti
nitrat) akan bertukar pasangan ion dengan ion positif dan negatif pada jembatan garam
protein. Selain itu garam merkuri sebagai salah satu garam logam berat juga mampu merusak
ikatan sulfida. Pada umumnya, protein yang ditambahkan garam merkuri akan menghasilkan
garam merkuri-protein yang tidak larut (mengendap) berwarna putih yang bila dipanaskan
akan berwarna merah apabila protein mengandung asam amino tirosin.
Albumin terkoagulasi karena pada uji Millon ini larutan yang telah ditambahkan reagen harus
dipanaskan di penangas air dengan air mendidih (>100 0C). Larutan albumin yang berada
pada suhu 50 0C ke atas akan mengalami koagulasi.
Karakteristik larutan protein yang memberi uji negatif pada Millon adalah protein-protein
yang tidak mengandung asam amino tirosin sebagai penyusunnya. Karena hanya tirosinlah
asam amino yang mengandung gugus fenol. Sedangkan warna merah pada uji Millon yang
positif merupakan konsekuensi dari gugus fenol yang bereaksi dengan ion merkuri.
Soal Uji Hopkins Cole
Asam amino apakah yang tidak memberikan uji positif dan mengapa?
Jawab:
Asam amino yang tidak memberikan uji positif pada uji Hopkins Cole adalah semua asam
amino kecuali triptofan. Karena hanya triptofanlah asam amino yang mengandung gugus
indol pada rantai sampingnya. Adapun cincin ungu dari uji Hopkins Cole merupakan
konsekuensi dari kondensasi inti indol oleh asam glioksilat dibantu dengan asam kuat
Soal Reaksi Sistin
Apa warna endapan? Senyawa apa yang mengedap?
Jawab:
Warna endapan adalah hitam. Endapan tersebut merupakan endapan Timbal (II) sulfida atau
PbS
Soal Nitroprussida
1. Apakah warna hasil percobaan? Apakah warna tersebut stabil?
2. Apakah sistin akan memberikan uji positif? Mengapa?
3. Gugus apa dari sistein yang memberikan hasil positif dengan nitroprussida?

Jawab:
1. Hasil percobaan menghasilkan warna merah yang tidak stabil. Warna tersebut tidak stabil
karena ketika diberikan amonium sulfat, warna larutan menjadi ungu dan kemudian
menjadi merah yang apabila didiamkan lebih lama lagi akan menjadi kuning.
2. Positif. Karena nitroprussida bereaksi dengan gugus sulfhidril pada sistein dalam
ammonia. Hasil positif akan ditunjukkan oleh perubahan menjadi warna merah yang
berasal dari reaksi gugus SH pada sistein dengan nitroprussida dalam amoniak.
3. Gugus sulfhidril.
Soal Pengendapan dengan Garam
Terangkan hasil yang diperoleh!
Jawab:
Hasil penyaringan albumin yang diendapkan dengan garam ammonium sulfat diuji dengan
reagen Millon. Hasil dari uji tersebut adalah positif karena mengandung endapan merah bata.
Dengan demikian, hasil penyaringan tersebut terbukti merupakan albumin (karena albumin
mengandung tirosin)
Uji Biuret dilakukan pada larutan filtrat albumin yang diendapkan dengan garam ammonium
sulfat. Hasilnya adalah negatif karena protein albumin telah mengendap sempurna.
Soal Denaturasi Protein
1. Sifat fisik protein apakah yang mempengaruhi kelarutan pada protein pada percobaan ini?
2. Perubahan sifat kimia apakah yang berhubungan dengan denaturasi telur?
Jawab:
1. Sifat fisik yang mempengaruhi kelarutan protein adalah titik isoelektriknya. Pada titik ini
protein mencapai titik kelarutan terendah, sehingga dapat terendapkan atau terkoagulasi
2. Perubahan sifat kimiawi yang berhubungan dengan denaturasi telur adalah ikatan kimia
pada struktur protein. Ikatan kimia yang tadinya membentuk struktur sekunder sampai
kuartener seperti ikatan sulfida, ikatan hidrogen, jembatan garam dan ikatan hidrofobik
akan putus akibat denaturasi protein
Soal Lowry
1. Buatlah kurva standar (A700nm vs ug protein) dan tentukan konsentrasi protein suatu
larutan yang diberikan!
2. Apa kebaikan dan kelemahan metode Lowry ini?
3. Berikan sedikitnya dua metode lain (secara spektofotometri) yang biasa digunakan untuk
menetukan konsentrasi protein selain metode Lowry. Berikan penjelasan mengenai metodemetode tersebut berikut kelebihan dan kekuranganya dibandingkan dengan metode Lowry!
Jawab :
1.

0.06
0.05
0.04
Absorbansi 0.03
0.02
0.01
0
0 20 40 60 80 100120140160180
Konsentrasi ( gram/mL)

kurva standar (A700nm vs ug protein)


Persamaan kurva: y = 4,8 10-3 + 2,925 10-4x
Absorbansi sampel (ys) = 0,0225
Konsentrasi sampel (xs) :
(0,0225) = 4,8 10-3 + 2,925 10-4xs
xs = 60,51 g / mL

2.
Kelebihan:

Lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret


Memerlukan sampel protein yang lebih sedikit.
Batas deteksinya berkisar sampai pada konsentrasi 0.01 mg/mL.

Lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.

Kelemahan:

3. Metode Lain:
a) Metode Dumas
Prinsip Umum
Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu tinggi (sekitar 900 C)
dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan C O3. H3O dan Ng. Gas C 03 dan H3O
dipisahkan dengan melewatkan gas pada kolom khusus untuk menyerapnya. Kandungan
nitrogen kemudian dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom dengan detektor
konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu memisahkan nitrogen dari
sisa C O3 dan H3O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis yang murni dan telah diketahui
jumlah nitrogennya. seperti EDTA (= 9.59 % N). Dengan demikian sinyal dari detektor dapat
dikonversi menjadi kadar nitrogen. Dengan metode Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen
dalam sampel menjadi kadar protein. tergantung susunan asam amino protein.

Keuntungan
o Jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran.
dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl).
0 Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik.
0 Banyak sampel dapat diukur secara otomatis.
o Mudah digunakan.
Kerugian
0 Mahal.
0 Tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya. karena tidak semua nitrogen dalam
makanan berasal dari protein.
o Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena susunan asam
amino yang berbeda.
0 Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.
2. 2 Pengukuran langsung pada 280 nm.
Prinsip Umum
Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uV pada 280 mn. Kandungan tryptophan
dan tyrosine berbagai protein umunmya konstan sehingga serapan larutan protein pada 280
nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya.
Keuntungan
Sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus.
Kerugian
Asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm, sehingga mengganggu pengukuran
protein jika ada dalam kadar yang bermakna.