LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Titrasi Formal Asam Amino

Oleh ANITA H SIMBOLON 06091010023

PROGRAM PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS SRIWIJAYA 2012

I. II. III.

Nomor Percobaan Nama Percobaan

: VI : Titrasi Formal Asam Amino

Tujuan Percobaan : Untuk mengetahui identifikasi asam amino secara kuantitatif

IV.

Landasan Teori

Asam amino dapat berperan sebagai asam dan sebagai basa, jika suatu kristal asam amino misalnya alanin, dilarutkan di dalam air, molekul ini menjadi ion dipolar, yang dapat berperan sebagai suatu asam (donor proton) atau sebagai basa (akseptor proton). Berdasarkan pada struktur rantai samping (R) asam-asam amino termasuk dalam golongan asam amino berikut: 1) rantai samping netral 2) rantai samping basa 3) rantai samping asam. 4) Asam Amino Netral Pada rantai samping netral, asam amino yang termasuk dalam golongan ini tidak mempunyai gugus karboksil maupun gugus fungsional basa dalam rantai sampingnya. Lima belas dari 20 asam amino termasuk dalam golongan ini. Asam amino netral ini dibagi dalam asam amino polar dan non polar. Contoh asam amino netral non polar : alanin, glisin, isoleusin, leusin, metionin, fenilalanin, triptofan, dan valin. Sedangkan asam amino netral polar : asparagin, sistein, glutamin, serin, threonin, tirosin. Asam amino netral non polar umumnya adalah yang paling sukar larut dalam air dari seluruh 20 asam amino ini. Pada pH 6-7 mereka berada sebagai ino dipolar yang netral. Tak satupun dari asam amino ini yang gugus fungsional rantai cabangnya dapat membentuk ikatan hidrogen dengan air (Nitrogen heterosiklik dari triptofan tak membentuk ikatan hidrogen dengan air karena pasangan elektronnya adalah sebagian dari awan elektron pi. Gugus sulfida dalam metionin tak polar sehingga tak membentuk ikatan hidrogen dengan air. Enam dari asam amino netral polar adalah karena rantai cabangnya mengandung gugus polar seperti:-OH. Asam amino ini lebih mudah larut dalam air daripada asam amino netral.

5) Asam Amino Basa Asam amino basa terdiri dari : arginin, histidin, dan lisin. Masing-masing dari asam amino ini mempunyai gugus fungsional yang dapat bereaksi dengan proton pada pH 6-7 dan membentuk senyawa ion yang bermuatan positif. Sehingga pada pH 6-7 suatu asam amino basa mempunyai dua muatan positif dan satu muatan negatif atau akhirnya sebuah muatan positif. 6) Asam Amino Asam Dua dari asam amino digolongkan ke dalam asam karena mempunyai gugus karboksil pada rantai cabangnya. Pada pH 6-7, rantai cabang karboksil ini akan melepaskan protonnya ke air untuk membentuk suatu bentuk dengan dau muatan negatif dan sebuah muatan positif sehingga pada pH 6-7 asam amino mempunyai muatan negatif. Prinsip dasar dari titrasi formol merupakan suatu titrasi asam basa, dimana penambahan formaldehid pada larutan asam amino dimaksudkan agar pH buffer gugus amino lebih rendah dari asalnya, sehingga gugus amino dapat dititrasi secara kuantitatif dan titik akhir dapat ditunjukan dengan terjadinya perubahan warna dari indikator. Dalam larutan, semua asam amino akan terionisasi dan dapat bersifat sebagai asam ataupun basa. Pengetahuan mengenai sifat-sifat asam basa dari asam amino sangat penting karena seni pemisahan, identifikasi dan penentuan kuantitatif asam amino dalam campuran juga penentuan komposisi asam amino dalam protein dapat dilakukan berdasarkan sifat asam basa yang khas. Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p.t akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang.

V.

Alat & Bahan 1. Pipet Tetes 2. Biuret 3. Bekker Glass 4. Inkubator 5. Erlenmeyer 6. NaOH 0,2 N 7. NaOH 0,02 N 8. Aquadest 9. Air seni 10. Larutan Gelatin 5% 11. Pipet volum 12. Formaldehid netral 13. Phenopthalein 14. HCl 0,1 M

VI.

Prosedur Siapkan 100 ml larutan gelatin 5%. Atur temperaturnya 380C. tambahkan kedalamnya 1 ml phenolphthalein dan 0,2 M NaOH tetes demi tetes sampai warna merah muda timbul. Tambahkan 0,1 M HCl tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda hilang (pH=8,0). Hati-hati jangan terlalu asam. Masukkan gelatin yang telah dinetralisir tadi kedalam incubator 38oC. Pada 25 ml larutan air seni tambahkan beberapa tetes phenolphthalein. Tambahkan tetes demi tetes 0,2 M NaOH sampai warna merah muda timbul. Kemudian teteskan 0,1 M HCl sampai warna merah muda hilang (pH=8,0). Tepat pada jan NOL tambahkan larutan air seni tersebut kedalam gelatin. Aduk ! setelah tercampur rata, ambil 10 ml campuran, masukkan kedalam 100 ml beaker glass. Didihkan untuk merusak enzim. Catat waktunya! Dinginkan. Tambahkan 15 ml formalin netral dan 3 tetes phenolphthalein. pada interval 15 menit lakukan hal yang sama seperti diatas (-seperti control-). Semua ini dilakukan duplo. Pada masing-masing hasil reaksi diatas (interval 0, 15, 30, 60, 90, dan 120 menit ) lakukan titrasi dengan 0,02 NaOH dengan titik akhir warna merah muda.

VII.

Hasil Pengamatan ket t1 tn 0 menit 0 menit 15 menit t2 15 menit 30 menit t3 30 menit 60 menit t4 60 menit 90 menit 90 menit 120 menit t6 120 menit Volume Titrasi 8,25 ml 9,5 ml 8,2 ml 8,8 ml 8,8 ml 8,9 ml 8,8 ml 9,0 ml 9,6 ml 9,7 ml 8,3 ml 9,4 ml Volume rata-rata 8,875 ml

8,5 ml

8,85 ml

8,9 ml

t5

9,65 ml

8,85 ml

VIII.

Reaksi Reaksi asam amino pada titrasi formol secara umum adalah sebagai berikut;
O R CH NH2 C OH NaOH R CH NH3+ pada pH Netral C OO

O R CH NH3+ C O + CH2O
-

R HOH2C

CH N Dimethilol

COOH CH2OH

Formalin

O R HOH2C CH N COOH CH2OH NaOH R HOH2C CH N C ONa CH2OH

IX.

Analisis Data a. Kurva titrasi antara volume alkali (ordinat) terhadap waktu (absis), dimana X = waktu Y = volume NaOH rata-rata X Y 0 8,875 15 8,5 30 8,85 60 8,9 90 9,65 120 8,85

Grafik

Kurva Larutan NaOH terhadap waktu

9.8 9.6 9.4 9.2 9 8.8 8.6 8.4 0 20 40 60 80 100 120 140

b. Hubungan antara waktu terhadap volume rata-rata dalam persamaan regresi linier:

X 0 15 30 60 90

Y 8,875 8,5 8,85 8,9 9,65

XY 0 127,5 265,5 534 868,5

X2 0 225 900 3600 8100

120 =315

8,85 = 53,625

1062 = 2857,5

14400 = 27225

Slope = A =

n(xy ) (x )( y ) n ( x 2 ) ( x ) 2
6 (2857 ,5) (315 ) (53,625 ) 6 (27225 ) (315 ) 2
17145 16891,875 = 0,003947 163350 99225

Intersept = B =

(x 2 )(y) (x)(xy) n(x 2 ) (x) 2

(27225 ) (53,625 ) (315 ) (2857 ,5) 6 (27225 ) (315 ) 2

559828,12 = 8,73 64125

maka diperoleh persamaan regresi linier : Y = AX + B Y = 0,003947x + 8,73 X Y 0 8,73 15 8,789 30 8,848 60 8,967 90 9,08 120 9,2

Kurva titrasi antara Volume dan waktu

9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 8.4 0 15 30 60 90 120

c. Data untuk mencari persamaan regresi linier, jika 1 ml NaOH 0,1 N = 1,4 mg nitrogen asam amino. X 0 15 30 60 90 120 = 315 Y 12,425 11,9 12,39 12,46 13,51 12,39 = 75,075 XY 0 178,5 371,7 747,6 1215,9 1468,8 = 3982,5 X2 0 225 900 3600 8100 14400 = 27225

Slope = A =

n(xy ) (x )( y ) n ( x 2 ) ( x ) 2 6 (3982 ,5) (315 ) (75,075 ) 6 (27225 ) (315 ) 2

23895 23648,63 = 0,0052 64125

(x 2 )(y) (x)(xy) Intersept = B = n(x 2 ) (x) 2

=
(27225 ) (75,075 ) (315 ) (3982 ,5) 6 (27225 ) (315 ) 2
2043916,9 1254487 = 12,31 264125

maka diperoleh persamaan regresi linier : Y = AX + B Y = 0,0052x + 12,31

X Y

0 12,31

15 12,39

30 12,47

60 12,62

90 12,78

120 12,93

grafik regresi linier asam amino

13 12.9 12.8 12.7 12.6 12.5 12.4 12.3 12.2 12.1 12 0 15 30 60 90 120 Column1

X.

Pembahasan Karena pada prinsipnya titrasi formol ini adalah titrasi asama basa, maka formalin, tripsin, dan gelatin yang digunakan pada percobaan harus dinetralkan dulu supaya tidak mengganggu hasil percobaan nantinya. Kondisi bahan-bahan yang tidak netral akan merubah kebutuhan Natrium Hidroksida dalam mentitrasi sampel. Apabila hal itu terjadi, maka data yang diperoleh tidak valid karena tidak sesuai dengan yang seharusnya. Inkubasi larutan dilakukan pada suhu 38oC. Hal ini disesuaikan dengan kondisi optimum aktivitas enzim untuk bereaksi dengan substrat dalam menghasilkan asam amino (produk). Pemanasan sampel larutan setelah masa inkubasi dimaksudkan untuk menghentikan aktivitas enzim sehingga tidak lagi bereaksi dengan substrat. Penghentian aktivitas enzim ini akan memberikan nilai/angka pasti terhadap produk yang dihasilkan, sehingga jumlah asam amino yang terbentuk tepat dan tidak bertambah lagi ketika proses titrasi berlangsung dan dapat diperhitungkan dengan benar. Gugus asam amino produk yang dihasilkan oleh reaksi enzimatik antara tripsin dan gelatin pada larutan sampel yang dititrasi oleh Natrium Hidroksida adalah gugus NH3+ yang bersifat asam, oleh karena ini titrasi ini pada prinsipnya dikatakan tritrasi asam basa. Kurva kebutuhan Natrium Hidoksida yang dibutuhkan untuk menetralkan gugus NH3+ pada titrasi formol ini dibandingkan dengan waktu/lama masa inkubasi menunjukkan garis yang terus naik dan kemudian menjadi datar. Ini menunjukkan bahwa pada masa inkubasi yang paling lama tersebut, jumlah substrat sudah habis bereaksi dengan enzimnya. Sehingga produk asam amino pada larutan memberikan konsentrasi yang konstan/tetap, oleh karena itu grafiknya akan membentuk garis pada posisi horizontal (mendatar). Laju pembentukan asam amino yang paling cepat terjadi pada kisaran 0-15 menit dari awal. Hal ini mungkin saja terjadi karena kuantitas asam amino yang ada pada saat itu masih cukup banyak dan kondisi aktivitas enzimatik yang sangat optimal sehingga laju nya paling cepat.

XI.

Kesimpulan 1. Suatu protein dapat ditentukan kadarnya secara kuantitatis melalui metoda titrasi formol yang didasarkan pada reaksi asam basa antara penitrasi (dalam hal ini Natrium Hidroksida) dan gugus NH3+ yang berasal dari produk asam amino 2. Hasil reaksi antara tripsin dan gelatin dimana reaksi enzimatik ini terjadi secara optimum pada suhu 38oC dan dihitung waktu kontaknya secara berkala. 3. Lama waktu kontak antara enzim dan substrat ini mempengaruhi jumlah asam amino yang dihasilkan selagi substrat masih tersedia. 4. Pemanasan larutan dilakukan untuk mematikan atau merusak enzim 5. Gugus amina diikat oleh formaldehid, sehingga protein menjadi bersifat asam dapat dititrasi menggunakan basa NaOH cocok untuk produk susu.

XII.

Daftar Pustaka Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1994, Kimia Organik , Erlangga, Jakarta

Lehninger, A.L., 1997, Dasar-dasar Biokimia Jilid 1, Erlangga, Jakarta.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia. UI-Press, Jakarta

http://andiscientist.blogspot.com/2010/08/titrasi-formol-asam-amino.html tanggal 9 april 2012)

(diakses

http://rgmaisyah.wordpress.com/2010/12/06/protein-3-metode-titrasi-formol/ (diakses tanggal 9 april 2012)

XIII.

Gambar Alat

Pipet Tetes

Gelas beker
0 10

Erlenmeyer

20

30

40

50

Biuret+Statif+klem Gelas Ukur

Tugas Pertanyaan & Jawaban 1. Buat kurva titrasi antara volume alkali (ordinat) terhadap waktu (absis) t(menit) Vol alkali (ml) 0 8,875 15 8,5 30 8,85 60 8,9 90 9,65 120 8,85

Grafik

Kurva Larutan NaOH (volume alkali) terhadap waktu

9.8 9.6 9.4 9.2 9 8.8 8.6 8.4 0 20 40 60 80 100 120 140

2. Buata kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu (absis) Jawab. Perhitungan mg N asam amino - 1ml NaOH 0,1 M ~ 5ml NaOH 0,02 M - 5 ml NaOH 0,02 M ~ 1,4 mg asam amino

Rumus perhitungan adalah : V rata-rata NaOH x 1,4 mg

5ml 0 menit = 8,875 ml x 1,4 mg = 2,485 mg 5 ml 15 menit = 8,5 ml x 1,4 mg = 2.38 mg 5 ml 30 menit = 8,85 ml x 1,4 mg = 2,478 mg 5 ml 60 menit = 8,9 ml x 1,4 mg = 2,492 mg 5 ml 90 menit = 9,65 ml x 1,4 mg = 2,702 mg 5 ml 120 menit = 8,85 ml x 1,4 mg = 2,478 mg 5 ml t (menit) mg 0 2,485 15 2,38 30 2,478 60 2,492 90 2,702 120 2,478

Kurva antara mg nitrogen asam amino terhadap waktu

2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 2.3 2.2 0 15 30 60 90 120

3. Mengapa harus ditambahkan alkali, formalin dan indicator phenolphthalein sampai merah muda? Jawab. Larutan protein dinetralkan dengan alkali basa NaOH dan formalin akan membentuk dimethilol yang mana menyebabkan gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempenngaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH dan di tambahi phenolphthalein agar terlihat perubahan warna pada larutan yang menendai titik akhir titrasi larutan yang mana titik akhir titrasi jika larutan berubah warna menjadi merah muda.

4. Apa tujuan melakukan titrasi formol ini ? Jawab. Untuk identifikasi gugus asam amino secara kuantitatif melaui titrasi asam basa.