Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

A. JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Asam Amino dalam Sampel

B. TANGGAL PERCOBAAN : Senin, 03 Oktober 2016, pukul 07.00 WIB
C. SELESAI PERCOBAAN : Senin, 03 Oktober 2016, pukul 09.30 WIB
D. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel
dengan kromatografi kertas
E. DASAR TEORI
A. ASAM AMINO
Protein termasuk dalam kelompok senyawa yang terpenting dalam organisme
hewan.Sesuai dengan peranan ini, kata protein berasal dari bahasa Yunani proteios,
yang artinya “pertama”. Protein adalah poliamida, dan hidrolisis protein menghasilkan
“asam-asam amino”. Hanya dua puluh asam amino yang lazim dijumpai dalam protein
tumbuhan dan hewan, namun keduapuluh asam amino ini dapat digabungkan menurut
berbagai cara, membentuk otot, urat, kulit, kuku, bulu, sutera, hemoglobin, enzim,
antibodi, dan banyak hormon (Girindra, 1990).
a. Pengertian dan Struktur Asam Amino
Nama asam amino menunjukkan bahwa senyawa ini mempunyai dua gugus fungsi
yaitu gugus karboksil yang bersifat asam dan gugus amino yang bersifat basa
(Lehninger, 1982). Asam- asam amino yang terdapat dalam protein adalah asam α-
aminokarboksilat. Asam amino tersederhana adalah asam aminoasetat
(H2NCH2CO2H) yang disebut glisina (glycine). Glycine tidak memiliki rantai
samping sehingga tidak mengandung satu karbon kiral.
b. Sifat Fisika Asam Amino
1) Titik leleh asam amino diatas 2000 oC, sedangkan kebanyakan senyawa organik
dengan bobot molekul sekitar itu berupa cairan pada temperatur kamar.
2) Larut dalam air dan pelarut polar lain tetapi tidak larut dalam pelarut nonpolar
seperti dietil eter atau benzena.
3) Momen dipol yang besar
4) Kurang bersifat asam dibandingkan sebagian besar asam karboksilat
5) Kurang basa dibandingkan sebagian besar amina.
c. Macam-macam Asam Amino
1) Asam amino esensial adalah asam amino yang diperoleh hanya dari makanan
sehari- hari karena tidak dapat disintesis di dalam tubuh. Jenis-jenis asam amino
esensial adalah: arginina, histidina, isoleusina, luesin, lisina, metionina,
fenilalanina, treonina, triptofan, valin.
1
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

2) Asam amino non esensial adalah asam amino yang dapat disintesis di dalam tubuh
melalui perombakan senyawa lain. Jenis asam amino non esensial yaitu: alanina,
asparagina, asam aspartat, sisteina, asam glutamat, glisina, prolina, serina,
tirosina.

Ada 20 macam asam amino, yang masing-masing ditentukan oleh jenis gugus
R atau rantai samping dari asam amino. Jika gugus R berbeda maka jenis asam amino
berbeda. Gugus R dari asam amino bervariasi dalam hal ukuran, bentuk, muatan,
kapasitas pengikatan hidrogen serta reaktivitas kimia. Keduapuluh macam asam
amino ini tidak pernah berubah. Asam amino yang paling sederhana adalah glisin
dengan atom H sebagai rantai samping. Berikutnya adalah alanin dengan gugus metil
(-CH3) sebagai rantai samping (Poedjiadi, 1994).

1) Alanin (Ala)
Alanin (Ala) atau asam 2-aminopropanoat merupakan salah satu asam amino
bukan esensial. Bentuk yang umum di alam adalah L-alanin (S-alanin) meskipun
terdapat pula bentuk D-alanin (R-alanin) pada dinding sel bakteri dan sejumlah
antibiotika. L-alanin merupakan asam amino proteinogenik yang paling banyak
dipakai dalam protein setelah leusin.
2) Arginin (Arg)
Asam amino arginin memiliki kecenderungan basa yang cukup tinggi akibat
eksesi dua gugus amina pada gugus residunya. Asam amino ini tergolong
setengah esensial bagi manusia dan mamalia lainnya, tergantung pada tingkat
perkembangan atau kondisi kesehatan.
3) Asparagin (Asn)
Asparagin adalah analog dari asam aspartat dengan penggantian gugus karboksil
oleh gugus karboksamid. Asparagin bersifat netral (tidak bermuatan) dalam
pelarut air. Asparagina merupakan asam amino pertama yang berhasil diisolasi.
Namanya diambil karena pertama kali diperoleh dari jus asparagus.
4) Asam aspartat (Asp)
Asam aspartat merupakan satu dari 20 asam amino penyusun protein. Asparagin
merupakan asam amino analognya karena terbentuk melalui aminasi aspartat
pada satu gugus hidroksilnya. Asam aspartat bersifat asam, dan dapat
digolongkan sebagan asam karboksilat. Bagi mamalia aspartat tidaklah esensial.

2
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

5) Sistein (Cys)
Sistein merupakan asam amino bukan esensial bagi manusia yang memiliki atom
S, bersama-sama dengan metionin. Atom S ini terdapat pada gugus tiol (dikenal
juga sebagai sulfhidril atau merkaptan). Karena memiliki atom S, sisteina menjadi
sumber utama dalam sintesis senyawa-senyawa biologis lain yang mengandung
belerang. Sisteina dan metionin pada protein juga berperan dalam menentukan
konformasi protein karena adanya ikatan hidrogen pada gugus tiol.
6) Glutamine (Gln)
Glutamin adalah satu dari 20 asam amino yang memiliki kode pada kode genetik
standar. Rantai sampingnya adalah suatu amida. Glutamina dibuat dengan
mengganti rantai samping hidroksil asam glutamat dengan gugus fungsional
amina. Glutamina merupakan bagian penting dari asimilasi nitrogen yang
berlangsung pada tumbuhan. Amonia yang diserap tumbuhan atau hasil reduksi
nitrit diikat oleh asam glutamat menjadi glutamina dengan bantuan enzim
glutamin sintetase atau GS.
7) Asam glutamate (Glu)
Asam glutamat termasuk asam amino yang bermuatan (polar) bersama-sama
dengan asam aspartat. Ini terlihat dari titik isoelektriknya yang rendah, yang
menandakan ia sangat mudah menangkap elektron (bersifat asam menurut
Lewis). Asam glutamat dapat diproduksi sendiri oleh tubuh manusia sehingga
tidak tergolong esensial. Ion glutamat merangsang beberapa tipe saraf yang ada
di lidah manusia. Sifat ini dimanfaatkan dalam industri penyedap.
8) Glisin (Gly)
Glisina atau asam aminoetanoat adalah asam amino alami paling sederhana.
Rumus kimianya C2H5NO2. Asam amino ini bagi manusia bukan merupakan
asam amino esensial karena tubuh manusia dapat mencukupi kebutuhannya.
Glisina merupakan asam amino yang mudah menyesuaikan diri dengan berbagai
situasi karena strukturnya sederhana. Secara umum protein tidak banyak
mengandung glisina. Pengecualiannya ialah pada kolagen yang dua per tiga dari
keseluruhan asam aminonya adalah glisina.
9) Histidin (His)
Histidina merupakan satu dari 20 asam amino dasar yang ada dalam protein. Bagi
manusia histidina merupakan asam amino yang esensial bagi anak-anak. Fungsi

3
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

Histidina menjadi prekursor histamin, suatu amina yang berperan dalam sistem
saraf, dan karnosin, suatu asam amino.
10) Isoleusin (Ile)
Isoleusina adalah satu dari asam amino penyusun protein yang dikode oleh DNA.
Rumus kimianya sama dengan leusinhidrofobik (tidak larut dalam air) dan
esensial bagi manusia. tetapi susunan atom-atomnya berbeda. Ini berakibat pada
sifat yang berbeda. Walaupun berdasarkan strukturnya ada empat kemungkinan
stereoisomer seperti treonin, isoleusina alam hanya tersedia dalam satu bentuk
saja.
11) Leusin (Leu)
Leusina merupakan asam amino yang paling umum dijumpai pada protein. Ia
mutlak diperlukan dalam perkembangan anak-anak dan dalam kesetimbangan
nitrogen bagi orang dewasa. Ada dugaan bahwa leusina berperan dalam menjaga
perombakan dan pembentukan protein otot. Leusina tergolong asam amino
esensial bagi manusia.
12) Lisin (Lys)
Lisina (bahasa Inggris lysine) merupakan asam amino penyusun protein yang
dalam pelarut air bersifat basa, seperti juga histidin. Lisina tergolong esensial bagi
manusia dan kebutuhan rata-rata per hari adalah 1- 1,5 g. Lisina menjadi kerangka
bagi niasin (vitamin B1). Kekurangan vitamin ini dapat menyebabkan pelagra.
13) Metionin (Met)
Metionina, bersama-sama dengan sistein, adalah asam amino yang memiliki atom
S. Asam amino ini penting dalam sintesis protein (dalam proses transkripsi, yang
menerjemahkan urutan basa nitrogen di DNA untuk membentuk RNA) karena
kode untuk metionina sama dengan kode awal (start) untuk suatu rangkaian RNA.
Biasanya, metionina awal ini tidak akan terikut dalam protein yang kelak
terbentuk karena dibuang dalam proses pascatranskripsi.
14) Fenilalanin (Phe)
Fenilalanina adalah suatu asam amino penting dan banyak terdapat pada
makanan, yang bersama-sama dengan asam amino tirosin dan triptofan
merupakan kelompok asam amino aromatik yang memiliki cincin benzene.
Fenilalanina bersama-sama dengan taurin dan triptofan merupakan senyawa yang
berfungsi sebagai penghantar atau penyampai pesan (neurotransmitter) pada
sistem saraf otak.
4
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

15) Prolin (Pro)

Prolina merupakan satu-satunya asam amino dasar yang memiliki dua gugus
samping yang terikat satu-sama lain (gugus amino melepaskan satu atom H untuk
berikatan dengan gugus sisa). Akibat strukturnya ini, prolina hanya memiliki
gugus amina sekunder (-NH-). Beberapa pihak menganggap prolina bukanlah
asam amino karena tidak memiliki gugus amina namun imina namun pendapat
ini tidak tepat.
16) Serine (Ser)
Serina merupakan asam amino penyusun protein yang umum ditemukan pada
protein hewan. Protein mamalia hanya memiliki L-serin. Serina bukan merupakan
asam amino esensial bagi manusia. Namanya diambil dari bahasa Latin, sericum
(berarti sutera) karena pertama kali diisolasi dari protein serat sutera pada tahun
1865. Strukturnya diketahui pada tahun 1902.
17) Treonin (Thr)
Treonina merupakan salah satu dari 20 asam amino penyusun protein. Bagi
manusia, treonina bersifat esensial. Tubuh manusia tidak memiliki enzim
pembentuk treonina namun manusia memerlukannya, sehingga treonina esensial
(secara gizi) bagi manusia. Kehadiran enzim treonina-kinase dapat menyebabkan
fosforilasi pada treonina, menghasilkan fosfotreonina, senyawa antara penting
pada biosintesis metabolit sekunder. Treonina banyak terkandung pada produk-
produk dari susu, daging, ikan, dan biji wijen.
18) Tritofan (Trp)
Triptofan merupakan satu dari 20 asam amino penyusun protein yang bersifat
esensial bagi manusia. Bentuk yang umum pada mamalia adalah, seperti asam
amino lainnya, L-triptofan. Meskipun demikian D-triptofan ditemukan pula di
alam (contohnya adalah pada bisa ular laut kontrifan).
19) Tirosin (Tyr)
Tirosina (dari bahasa Yunani tyros, berarti keju, karena ditemukan pertama kali
dari keju) merupakan satu dari 20 asam amino penyusun protein. Ia memiliki satu
gugus fenol (fenil dengan satu tambahan gugus hidroksil). Bentuk yang umum
adalah L-tirosin (S-tirosin), yang juga ditemukan dalam tiga isomer struktur: para,
meta, dan orto. Pembentukan tirosina menggunakan bahan baku fenilalanin oleh
enzim Phe-hidroksilase. Enzim ini hanya membuat para-tirosina. Dua isomer

5
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

yang lain terbentuk apabila terjadi “serangan” dari radikal bebas pada kondisi
oksidatif tinggi (keadaan stress).
20) Valin (Val)
Valina adalah salah satu dari 20 asam amino penyusun protein yang dikode oleh
DNA. Dalam ilmu gizi, valina termasuk kelompok asam amino esensial.
Namanya berasal dari nama tumbuhan valerian (Valeriana officinalis). Sifat
valina dalam air adalah hidrofobik (‘takut air’) karena ia tidak bermuatan. Pada
penyakit anemia “bulan sabit” (sel-sel eritrosit tidak berbentuk seperti pil tetapi
seperti bulan sabit, sickle-cell anaemia), valina menggantikan posisi asam
glutamat, asam amino lain yang hidrofilik (‘suka air’), pada hemoglobin.
Akibatnya bentuk sel berubah dan kehilangan kemampuan mengikat oksigen
secara efektif.

B. KROMATOGRAFI
Definisi kromatografi secara lengkap dikemukakan oleh Keulmans pada tahun
1959, yang menyatakan bahwa kromatografi adalah salah satu metode analisis
pemisahan secara fisika, dimana komponen yang akan dipisahkan, didistribusikan
diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.
Definisi kromatografi menurut IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemistry), kromatografi adalah metode yang digunakan terutama untuk
memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan
diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau
cairan yang dilapiskan pada padatan atau gel.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen-komponen campuran diantara dua fase, yaitu fase diam (padat
atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Bila fase diam berupa zat padat yang aktif,
maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase
diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition
chromatography).
Prinsip Dasar Kromatografi
Prinsip dasar kromatografi yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda saat
kesetimbangan antara fase diam dan fase geraknya. Pemisahan dengan metode
kromatografi dapat terjadi apabila suatu molekul maupun senyawa memiliki beberapa
sifat yang berbeda, antara lain:
6
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

a) Mempunyai kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut.

b) Mempunyai sifat kelarutan maupun sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama
lain dengan fase diamnya.
c) Memiliki sifat mudah menguap (volatil) pada temperatur yang berbeda.

Pemisahan secara kromatografi, menempatkan senyawa-senyawa yang akan

dipisahkan pada fasa geraknya yang kemudian mengalir melalui suatu sistem stationer
(fase diam), dimana selama proses pengaliran tersebut akan terjadi interaksi antara
komponen senyawa dengan fase diamnya. Selama berinteraksi akan terjadi proses
pelarutan, adsorpsi maupun penguapan dari komponen senyawa yang akan dipisahkan.
Sifat-sifat dari komponen penyusun senyawa tersebut akan menentukan apakah
komponen-komponen tersebut mampu bergerak atau tidak dalam fase diamnya. Bila
semua komponen-komponen yang ada tidak dapat bergerak dalam fase diam, maka
proses pemisahan tidak mungkin dapat berlangsung. Apabila dapat bergerak, sejauh
mana kecepatan bergerak di antara komponen-komponen tersebut maupun perbedaan
kecepatannya dengan kecepatan fasa gerak yang dipakai pada sistem tersebut. Oleh
karena itu pada metoda kromatografi perlu dilakukan pemilihan fase gerak sedemikian
rupa sehingga semua komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda
sehingga proses pemisahan dapat terjadi. Secara umum dapat dikatakan bahwa
kromatografi adalah proses migrasi diferensial dimana komponen-komponen sampel
ditahan secara selektif oleh fase diam.

1) Klasifikasi jenis kromatografi berdasarkan sistem geometrinya dapat dibagi

menjadi : Kromatografi kolom, dimana fase diamnya berupa pipa yang berbentuk
kolom. Pada kromatografi kolom, komponen yang akan dipisahkan bergerak
bersama fase gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen akan
terpisahkan. Setiap komponen yang keluar dari kolom akan masuk ke detektor
untuk analisis kuantitatif. Hasilnya disajikan dalam bentuk puncak (peak)
yang mengidentifikasikan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Tinggi atau
luasan puncak sebanding dengan konsentrasi komponen sampel.
2) Kromatografi Planar (Kromatografi lapis tipis), fase diamnya berupa film tipis
dengan partikel padat yang terikat bersama melalui kekuatan mekanik pada
senyawa pengikat seperti kalsium sulfat. Pada kromatografi planar, komponen
yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar.
Senyawa yang bergerak berupa noda (spot) yang dapat dikenali. Posisi noda
7
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

menunjukkan identitas suatu komponen/senyawa, sedangkan besar atau intensitas

noda menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar ini beberapa bercak
komponen/senyawa dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan
dengan dua langkah, dimana langkah yang kedua tegak lurus arahnya dengan
langkah yang pertama. Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.

Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona realtif terhadap garis depan

pengembang. Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh
nilai-nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan oleh hubungan (Tim, 2016) :

Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona

𝑅𝑓 =
jarak (cm)𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑔𝑎𝑟𝑖𝑠 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑘𝑒𝑔𝑎𝑟𝑖𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan

(pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona.
Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan
menunjukkan identitas suatu zat yang dicari, contohnya asam amino dan intensitas zona
itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan noda-
noda standar (Motngomery, Driyer, Conway, & Spector, 1993).

Kromatografi kertas dapat dilakukan dengan satu dimensi atau dua dimensi.
Apabila macam komponen tidak terlalu banyak maka biasanya cara satu dimensi cukup
memuaskan. Tetapi, jika hasilnya meragukan dan ini biasanya disebabkan karena
macam komponennya terlalu banyak, maka cara 2 dimensi seringkali diperlukan. Untuk
ini diperlukan 2 macam larutan eluen, yang satu diperlukan untuk ke satu arah dan yang
kedua untuk ke arah lain yang tegak lurus pada satu elusi pertama, setelah kertas
kromatografinya kering. Umumnya kertas kromatografi yang berukuran 35 x 35 cm
adalah yang memenuhi syarat (Page, 1997).
Pada percobaan ini penyemprotan dengan larutan ninhidrin dilakukan untuk
pewarnaan noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering. Asam-
asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang disebut
ungu Ruhman. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi
adanya asam amino pada kertas kromatografi (Tim, 2016).

8
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

F. ALAT DAN BAHAN

1 Alat :
Alat-alat yang dibutuhkan dalam percobaan ini yaitu :
1. Kertas kromatografi 4x10 cm 1 buah
2. Chamber 1 buah
3. Kaca kapiler 4 buah
4. Botol semprot 1 buah
5. Oven 1 buah
6. Pinset 1 buah
7. Kaca arloji 1 buah
2 Bahan :
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam percobaan ini yaitu:
1. asam asetat glasial
2. n-butanol
3. larutan asam amino standart (glysin dan taurin)
4. larutan sampel (uji glysin dan taurin)
5. ninhidirin

G. ALUR KERJA
1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (Eluen)

-
-
-
-
-

CH3COOH (aq) + C4H9OH (aq)  CH3COOC4H9 (aq) + H2O (l)

CH3COOC4H9 (aq) + H2O (l)  CH3COOC4H9 (aq)

9
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

2. Penentuan Komponen Asam Amino

Kertas kromatogrfi 4 x 10 cm

-
-

-
-

-
-

-
-

Noda berwarna asam amino

-
-
-
-

Rf tiap noda Warna Asam amino

10
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

H. HASIL PENGAMATAN

No. per Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan Reaksi Kesimpulan

1. Pembuatan larutan Pengemulsi (Fasa Gerak) Sebelum: Dugaan: Berdasarkan
 n-butanol: larutan Eluen dapat naik melalui plat KLT karena harga Rf, sampel
25 mL n-butanol tidak berwarna perbedaan sifat, antara silika yang bersifat 1 merupakan
 Asam asetat glasial: glisin
non polar dan eluen yang bersifat non
larutan tidak
- Ditambah 6 mL asam asetat glasial berwarna polar
- Ditambah 25 nL aquades  Aquades: larutan Reaksi:
- Dikocok tidak berwarna - CH3COOH (aq) + C4H9OH (aq) →
- Dimasukkan ke dalam chamber Sesudah: CH3COOC4H9 (aq) + H2O (l)
- Dijenuhkan dengan uapnya  n-butanol + aquades: - CH3COOC4H9 (aq) + H2O (l) →
larutan tak berwarna CH3COOC4H9 (aq)
 n-butanol + asam
Larutan Pengemulsi asetat glasial +
aquades : larutan
jenuh tidak berwarna

11
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

2. Pelat/kertas kromatografi (4×10) cm Sebelum: Dugaan:

 Kertas kromatografi : Reaksi antara asam amino dengan
- Digaris dengan pensil batas bawah 1 cm, batas pelat berwarna putih ninhidrin akan menunjukkan hasil positif
 Larutan A (Glisin) : yang ditandai dengan warna
atas 0,5 cm
larutan tidak berwarna Harga Rf larutan standar:
- Dioven selama 5 menit  Larutan B (L-sistein): Glisin = 0,26
- Ditotolkan 3 macam larutan standar (A, B, C) larutan tidak berwarna Sistein = 0,25
menggunakan pipa kapiler dengan jarak antar  Larutan C (Alanin) : Alanin = 0,38
totolan sebesar 1 cm larutan tidak berwarna Reaksi:
- Ditotolkan satu sampel pada pelat  Sampel : larutan tidak Reaksi sistein dengan ninhidrin:
O
berwarna H O
- Dioven selama 5 menit
 Ninhidrin:
OH
larutan H2N C C
OH
+

Kertas Kromatografi Bernoda tidak berwarna CH2

OH
SH
Sesudah: O

- Digantung dalam lemari kromatografi selama  Larutan standar (A, B,

C) dan S1 ditotolkan
beberapa jam untuk dijenuhkan dengan uap
sebanyak 2 tetes
eluen  Dielusi selama ± 90
H2 O
- Dimulai elusi setelah penjenuhan selesai menit + dioven : noda + HS C C + CO2 + H2O
- Dikeluarkan pelat setelah larutan eluen tidak nampak H
berjalan sampai hampir tanda batas  Disemprot dengan Reaksi alanin dengan ninhidrin:
- Dioven selama 5 menit pada suhu 105-110°C Ninhidrin + dioven:
nampak noda-noda
Noda Tak Berwarna berwarna jingga
 Harga Rf:
1,6
 A = 8,6 = 0,186
 B = 𝑡𝑖𝑑𝑎𝑘 𝑎𝑑𝑎
1,9
 C = 8,6 = 0,221
1,6
S1= 8,6 = 0,186

12
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

Prinsip dasar
Noda Tak Berwarna
kromatografi kertas yaitu Reaksi Glisin + Ninhidrin :
partisi multiplikatif suatu
- Disemprot dengan Ninhidrin senyawa antara dua
- Dioven selama 1 menit cairan yang saling tidak
bercampur. Jadi partisi
Noda-Noda Asam Amino suatu senyawa terjadi
antara kompleks selulosa-
air dan fasa gerak yang
- Diletakkan dibawah sinar UV melewatinya berupa
- Ditentukan batas atas eluen pelarut organik yang
- Dilingkari noda-noda asam amino yang sudah dijenuhkan dengan
nampak air atau campuran pelarut.
- Dihitung harga Rf tiap titik (A, B, C, dan S2)

Harga Rf Tiap Asam Amino

13
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

I. ANALISIS DAN PEMBAHASAN

Pada percobaan yang berjudul “Penentuan Kadar Asam Amino dalam Sampel”
bertujuan untuk “mentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan metode
kromatografi kertas”. Kromatografi merupakan cara pemisahan campuran yang
didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen dalam campuran
diantara dua fase, yaitu : fase gerak dan fase diam.
1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (Fasa Gerak)
Pada percobaan 1 yaitu pembuatan larutan pengemulsi bertujuan untuk
membuat eluen atau larutan pengemulsi sebagai fase gerak. Pembuatan larutan
pengemulsi dengan cara mencampurkan 25 mL n-butanol larutan tak berwarna, 6
mL asam asetat glasial larutan tak berwarna dan 25 mL aquades larutan tak berwarna
menghasilkan larutan pengemulsi larutan yang tak berwarna.
Pemilihan pengemulsi ini karena ketiga komponen larutannya memiliki
kepolaran yang berbeda. Urutan kepolaran pelarut : kepolaran air > n-butanol > asam
asetat glasial. Perbedaan kepolaran inilah yang digunakan sebagai dasar dalam
pemisahan asam amino, karena setiap asam amino memiliki kemampuan larut pada
pelarut dengan kepolaran yang berbeda-beda. Dalam larutan pengemulsi ini terjadi
perbedaan fase karena air akuades merupakan senyawa polar sedangkan n-butanol
merupakan senyawa non-polar. Sehingga adanya pengocokan akan mempermudah
terjadinya proses distribusi antara air dan n-butanol.
n-butanol pelarut non-polar sebagai fase gerak, dan air pelarut polar sebagai fase
diam. Sedangkan asam asetat glasial dalam pembuatan eluen ini bertujuan untuk
mendistribusikan kedua pelarut (air dan n-butanol) yang tidak saling bercampur,
sehingga ketida larutan bisa bercampur dalam volume tertentu dan menjadi 3 fasa
yang berbeda. Larutan emulsi tersebut dicampur dan dikocok, dimasukkan dalam
chamber sambil ditutup dan dijenuhkan dengan uapnya. Penutupan chamber ini
untuk menjaga kondisi dalam chamber tersebut jenuh oleh uap dari eluen.
2. Penentuan Kadar Asam Amino dalam Sampel
Pada percobaan keduan penentuan kadar asam amino dalam sampel bertujuan
untuk mengetahui kadar asam amino dalam suatu sampel. Langkah-langkah yang
dilakukan yaitu persiapan pelat KLT. Kertas kromatografi yang berukuran 4 x 10
cm diberi garis sebagai batas bawah dan atas masing-masing 1 cm dan 0,5 cm. Pada
pemberian tanda batas pada pelat menggunakan pensil agar ketika eluen melewati
plat garis yang dibuat tidak tertarik ikut eluen, beda halnya jika memakai bolpoin.
14
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

Kemudian diberi tanda totolan untuk 4 macam larutan yang diberi label A, B, C
dan S dengan jarak 1 cm tiap totolan. Label S adalah larutan sampel, label A adalah
larutan standar asam amino alanin, label B adalah larutan standar asam amino
glisin, dan label C adalah larutan standar asam amino sistein. Setelah selesai
pemberian label, kertas kromatografi, pelat KLT dioven selama ±10 menit pada
suhu 105-110C.
Setelah kertas kromatografi dioven selama ± 10 menit, sampel ditotolkan pada
tiap titik yang telah ditandai sebanyak 1 kali menggunakan pipa kapiler dengan
posisi tegak lurus terhadap kertas kromatografi. Selanjutnya kertas kromatografi
dimasukkan menggunakan pinset (posisi bawah pelat menyentuh dasar) ke dalam
lemari kromatrografi yang telah jenuh dengan uap pengemulsi dan ditutup dengan
kaca kembali dan ditunggu sampai larutan pengemulsi bergerak sampai batas atas
pada kertas kromatografi.
Pelat KLT diangkat dari chamber ketika eluen sudah sampai pada batas atas
dan selanjutnya disemprot ninhidrin dan dioven pada suhu 106C selama ±5 menit.
Tujuan penyemprotan dengan ninhidrin adalah untuk mengetahui distribusi asam
amino karena asam amino tidak berwarna akan berwarna ketika disemprot dengan
ninhidrin. Sesuai reaksi berikut

Eluen yang berjalan tersebut kemudian dihitung untuk mengetahui nilai Rf

sampelnya, dengan rumus nilai Rf sebagai berikut :
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑅𝑓 =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛
Prinsip dasar pemisahan dengan kromatografi kertas adalah perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Saat larutan bergerak ke atas pada kertas
kromatografi secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino
antara fase gerak dan fase diam yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung
berulang-ulang. Saat larutan bergerak ke atas, asam amino akan terbawa oleh
pergerakan eluen. Perbedaan kelarutan asam-asam amino dalam eluen akan
mengakibatkan kecepatan pergerakan asam-asam amino yang berbeda pada kertas

15
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

kromatografi tersebut. Asam amino yang lebih larut dalam eluen akan bergerak
lebih cepat karena hanya tertahan kecil dalam fasa diamnya. Sedangkan asam
amino yang lebih susah larut dalam eluen akan lebih lama tertahan pada fase
diamnya, sehingga laju geraknya lebih lambat. Dengan adanya perbedaan
pergerakan ini, asam amino-asam amino dapat dipisahkan.
Diketahui jarak yang ditempuh eluen adalah sebesar 8,6 cm. Maka
didapatkan jarak noda pada sampel 1, larutan standar A, larutan standar B dan
larutan standar C beserta nilai Rf sebagai berikut :
Titik Asam amino Jarak eluen Jarak Rf (cm)
(cm) noda (cm)
S Sampel 1 8,6 1,6 0,186
A Larutan standar A 8,6 1,6 0,186
B Larutan standar B - - -
C Larutan standar C 8,6 1,9 0,221

Alanin mempunyai gugus R non polar dan glisin mempunyai gugus R polar,
tetapi gugus R pada glisin, yaitu suatu atom hidrogen terlalu kecil untuk
mempengaruhi derajat polaritas gugus α-amino dan α-karboksil yang tinggi. Hal
ini sesuai dengan hasil Rf yang diperoleh dari kedua eluen untuk masing-masing
asam amino. Sehingga urutan kepolarannya dari yang paling polar adalah : Glisin
> Alanin > Sistein.
Keterangan : A Glisin, B adalah sistein, dan C adalah alanin.
J. DISKUSI
Pada percobaan kami, tidak terbentuk noda asam amino pada larutan standar B. Sehingga
tidak dapat dihitung Rf dari asam aminonya. Hal ini dapat dipengaruhi oleh beberapa
faktor seperti fase gerak yang kurang murni, sampel yang telah kadaluarsa, kurangnya
penotolan sampel, penguapan yang cepat dari pelarut spray reagent, kondisi percobaan
seperti tempertur, ukuran spot, kualitas kertas, kejenuhan bejana.

K. KESIMPULAN

Kesimpulan yang kami dapat dari percobaan ini yaitu Berdasarkan harga Rf, sampel 1
merupakan asam amino glisin.

16
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

DAFTAR PUSTAKA

Budianto, A. K. (2009). Dasar-dasar Ilmu Gizi. Malang : UMM Press.

Girindra, A. (1990). Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia.
Hart, H. (1990). Kimia Organik Suatu Bahan Kuliah Singkat. Jakarta:
Erlangga.
Kartasapoetra, G. (1986). Imu Gizi (Korelasi Gizi, Kesehatan dan
Produktivitas Kerja). Jakarta: Rineka Cipta.
Lehninger, A. (1982). Dasar-Dasar Biokimia Jilid I. Jakarta: Erlangga.
Motngomery, R., Driyer, R. L., Conway, T. W., & Spector, A. A. (1993).
Biokimia : Suatu Pendekatan Berorientasi Kasus. Yogyakarta: Gadjah
Mada University Press.
Page, D. S. (1997). Prinsip-prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Poedjiadi, A. (1994). Dasa-dasar Biokimia. Jakarta: Uiversitas Indonesia
Press.
Tim. (2016). Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Kimia FMIPA Unesa.
Yuniastuti, A. (2008). Gizi dan Kesehatan. Yogyakarta: Graha Ilmu.

17
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

LAMPIRAN 1 : Daftar Nilai Rf 20 Asam Amino

Amino acid Rf value

alanine 0.38
arginine 0.20
asparagine 0.5
aspartic acid 0.24
cysteine 0.4
glutamine 0.13
glutamic acid 0.30
glycine 0.26
histidine 0.11
isoleucine 0.72
leucine 0.73
lysine 0.14
methionine 0.55
phenylalanine 0.68
Proline 0.43
not a true amino acid - shows up as yellow
serine 0.27
threonine 0.35
tryptophan 0.66
tyrosine 0.45
valine 0.61

18
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

LAMPIRAN 2 : JAWABAN PERTANYAAN

1. Apakah keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan kromatografi

kertas?
Jawab:
Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam.Fase
gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
a. Keuntungan :
1) Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah
pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.
2) Dapat digunakan untuk sampel yang sangat kecil
3) Proses pemisahan relatif mudah dan cepat
b. Kerugian :
1) Pelarut yang digunakan harus sesuai dengan sampel yang akan digunakan.
Misalnya ketika menggunakan pelarut polar, molekul-molekul polar akan
memiliki atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk
pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan
tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena
molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan
kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat
pada kertas.
2) Jika kertas yang digunakan kurang tepat akan mempengaruhi tingkat
kesempurnaan pemisahan, difusias pembentukan spot efek tailing, pembentukan
komet serta laju pergerakan
3) Jika kertas tidak diletakkan tegak lurus dengan chamber maka akan terjadi
pencampuran noda, sehingga sulit menghitung nilai Rf
2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif?
Jawab:
Tidak. Metode kromatografi kertas hanya bisa digunakan untuk analisa kualitatif
karena data dari hasil kromatografi hanya diperoleh nilai Rf. Dan data kualitatif yang
diperoleh tidak serinci data kualitatif dari analisis inframerah, NMR, spektrum massa.
Sedangkan untuk kuantitatif seperti menghitung kadar sampel itu tidak bisa dilakukan
karena tidak ada data lain yang diketahui kecuali nilai Rf, karena analisa kuantitatif

19
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

didasarkan atas perbandingan antara tinggi puncak atau luas area puncak-puncak
analit terhadap puncak satu atau lebih zat standar.
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
Jawab:
Faktor-faktor yang menentukan harga Rf antara lain:
Eluen
Perubahan yang sangat kecil komposisi eluen dapat menyebabkan perubahan harga
Rf, karena perubahan komposisi eluen akan mempengaruhi koefisien distribusi.
Suhu
Perubahan suhu akan mempengaruhi harga koefisien distribusi dan kecepatan
aliran eluen.
Ukuran bejana
Volume bejana akan mempengaruhi homogenitas atmosfer dalam bejana dan
pencapaian tingkat kejenuhan bejana. Jika digunakan bejana besar maka ada
tendensi elusi terjadi lebih lama, terjadi perubahan komposisi pelarut sepanjang
kertas, sehingga akan mempengaruhi koefisien distribusi.
Kertas
Ketebalan dan kerapatan kertas akan mempengaruhi kecepatan aliran sehingga
akan mempengaruhi kesetimbangan partisi.
Sifat campuran
Berberapa senyawa akan mengalami partisi di antara volume-volume yang sama
dari fase diam dan fase gerak, sehingga hampir selalu mempengaruhi karakteristik
kelarutan satu terhadap yang lain.

20
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

LAMPIRAN 3 : DOKUMENTASI

Alur Foto Keterangan

Kertas kromatografi Kertas kromatografi
4x10 cm gigaris bawahi yang sudah digaris
dan bawah dan atas dan siap
untukdioven dan
selanjutnya masukkan
dalam eluen

dioven pada sushu 105oC Proses pengovenan

kertas kromatografi

Ditotolkan larutan A, B, setelah dioven barulah

C, dan S dengan jarak ditotolkan larutan
antar totolan 1 cm santaar asam amino dan
menggunakan pipa larutan sampel yang
kapiler diujikan

21
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

Dijenuhkan diatas lemari Setelah ditotolkan maka

kromatografi dengan selanjutnya dimasukkan
cara digantung beberapa dalam eluen dan
jam. Setelah jenuh ditunggu sampai eluen
dikromatografi mendaki sampai pada batas garis
atau menurun.
atas.
Dikeluarkan kertas
kromatografi setelah
eluen mencapai batas
atas

dikeringkan pada suhu Setelah dimasukkan

105-110oC ±5 menit dalam eluen, kertas
kromatograsi dioven lagi

Setelah dioven lalu Tampak kertas

disemprot dengan kromatografi yang sudah
ninhidrin dioven tapi belum
disemprotkan ninhidrin

22
 Laporan Praktikum Biokimia I | ASAM AMINO

Noda warna asam Tampak kertas

amino. Ditandai kromatografi yang sudah
dengan pensil. di semprot ninhidrin.
Dihitung Rf tiap noda. Tampak muncul warna
Dicatat warnanya. dari asam amino standar
Ditentukan asam dan asam amino sampel
aminonya

Ditaruh disinar UV Proses penyinaran UV

untuk meliahat sampel agar sampel dan standart
pada kertas terlihat lebih jelas
kromatografi

23