ACARA I.

ISOLASI PLASMID (pGLO)

DASAR TEORI
Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler utas ganda yang berukuran kecil yaitu antara
1 kb - 200 kb (Snyder & Champness 2007). Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau
lebih dan sering kali gen-gen tersebut menyebabkan adanya ciri-ciri penting yang
ditunjukkan oleh bakteri inangnya. Salah satu sifat yang mungkin dimiliki adalah keberadaan
gen yang dapat resisten terhadap antibiotik. Hal ini dapat digunakan sebagai suatu ​selectable
marker untuk memastikan bahwa bakteri dalam kultur mengandung gen tertentu. Plasmid
memiliki satu urutan rangkai DNA yang dapat bertindak sebagai ​origin of replication​,
sehingga plasmid mampu memperbanyak diri didalam sel dan tidak tergantung pada
kromosom bakteri ( Brown, 2003). Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu plasmid
dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak mengkodekan fungsi yang
penting untuk pertumbuhan sel tersebut.
Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada
keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA
plasmid dapat dibuang. Sebagian besar plasmid memiliki struktur sirkuler, namun ada juga
plasmid linear yang dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu, seperti ​Borrelia
burgdorferi dan ​Streptomyces​. Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas ganda yang
sebagian besar tersusun menjadi superkoil atau kumparan terpilin. Struktur superkoil terjadi
karena enzim topoisomerase membuat sebagian DNA utas ganda lepas (tidak terikat) selama
replikasi plasmid berlangsung. Struktur superkoil akan menyebabkan DNA plasmid berada
dalam konformasi yang disebut lingkaran tertutup kovalen atau ​covalently closed circular
(ccc), namun apabila kedua utas DNA terlepas maka akan plasmid akan kembali dalam
keadaan normal (tidak terpilin) dan konformasi tersebut disebut sebagai open circuler (oc).

Gambar 1. Pengamatan mikroskop elektron plasmid saat kondisi normal dan superkoil
 Plasmid yang digunakan pada praktikum isolasi plasmid ini adalah plasmid pGLO.
Plasmid pGLO merupakan plasmid modifikasi yang disisipi gen yang mengkodekan ​Green
Fluorescent Protein (GFP). Plasmid ini memiliki ukuran 5400 bp dan membawa titik ​ori​, gen
GFP, regulator ​ara ​C (pengatur ekspresi dari gen GFP), gen resistensi terhadap antibiotik
ampicillin. Peta plasmid pGLO dapat diamati lebih jelas pada Gambar 2.

TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dari praktikum Isolasi Plasmid adalah sebagai berikut :
1. Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami tahapan-tahapan isolasi DNA plasmid
dengan meode ​alkaline lysis
2. Mahasiswa mampu memahami pengertian, fungsi, karakteristik, dan bagian-bagian dari
plasmid pGLO

METODE PRAKTIKUM
a. Bahan
Bahan yang digunakan dalam acara praktikum Isolasi Plasmid adalah sebagai berikut :
1. Solution I (150mM glukosa, 25mM Tris Cl (pH 8.0), RNAse, 10 mM EDTA (pH 8.0))
2. Solution II (0,2 n NaOH, 1% SDS)
3. Solution III (60 ml 5M potassium acetate, 11,5 ml Glacial acetic acid, 28,5 ml H​2​O)
4. Isopropanol
5. Buffer TE
6. Ethanol pa dan EtOH 70%

b. Alat
Alat yang digunakan dalam acara praktikum Isolasi Plasmid adalah sebagai berikut :
1. Mesin sentrifugasi berpendingin
2. Micropipet
3. Erlenmeyer
4. Tabung falcon
5. Pipet
6. Pipet ukur
7. Ice box / freezer
c. Cara kerja
Langkah kerja dan dasar teori terkait plasmid pGLO dapat dilihat pada link video
praktikum yang tertera dibawah ini.
1. https://youtu.be/WZbAfQ58eCw​ (langkah kerja)
2. https://youtu.be/8EBoK1Ft3QA​ (dasar teori)

HASIL LAPORAN
Hasil laporan praktikum Isolasi Plasmid yaitu dalam bentuk gambar plasmid pGLO yang
didapatkan dari melihat video dasar teori praktikum.

PEMBAHASAN LAPORAN
Pembahasan laporan dari praktikum Isolasi Plasmid adalah sebagai berikut :
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan plasmid dan pembagiannya berdasarkan gen yang
dibawanya
2. Jelaskan tentang plasmid pGLO meliputi; fungsi, karakteristik, bagian-bagiannya, dst
3. Jelaskan pengertian dan prinsip kerja dari metode isolasi plasmid ​alkaline lysis
4. Jelaskan fungsi setiap perlakuan dan larutan yang digunakan