“SAYA MENGERJAKAN LAPORAN INI DENGAN SEJUJUR-JUJURNYA

MENGGUNAKAN REFERENSI TERPERCAYA DAN DENGAN USAHA

SAYA SENDIRI”

Nama : Hijratul Abdi

NPM : 2008104010053
Kelas : A
Asisten: Muniratul Aufa

Laporan 2
Tanggal praktikum : 4 oktober 2021
Judul praktikum : Identifikasi DNA Genom Dari Bakteri
Tujuan praktikum : mengetahui cara isolasi dan identifikasi DNA dari Bakteri (strepcoccus
pneumoniae)
Pertanyaan:
1. Jelaskan 3 tahapan untuk mengidentifikasi DNA bakteri!
2. Mengapa ekstraksi DNA bakteri pada praktikum ini menggunakan Phase LockGel
documentation System.
Jawaban:
1. Bakteri adalah salah satu jenis organisme yang tidak memiliki inti sel tidak
organisme lainnya. Ia masuk ke dalam kelompok prokariota yang berukuran sangat
kecil . Untuk melihat keberadaan bakteri ini, manusia mutlak membutuhkan alat
pembesar berupa mikroskop. Sebagai sel prokariot, bakteri mempunyaI struktur yang
teramat sangat sederhana. Ia terdiri dari kerangka sel serta organel-organel semisal
mitokondria dan juga kloroplas. Bakteri dapat ditemui di semua tempat. Contohnya di
udara, air, tanah dan tempat lainnya. Bakteri memiliki bentuk sel yang bervariasi, bulat
(coccus), batang (bacillus) dan engkung (vibrio, coma atau spiral). Umumnya sel
bakteri yang berbentuk bulat berdiameter sekitar 0,7 – 1,3 mikron Sedangkan sel
bakteri berbentuk batang lebarnya sekitas 0,2 – 2,0 Mikron dan panjangnya 0,7 – 3,7
mikron.Bagian tubuh bakteri pada umumnya dapat dibagi atas 3 bagian yaitu dinding
sel, protoplasma (di dalamnya terdapat membrane sel, mesosom, lisosom, DNA,
endospora), dan bagian yang terdapat di luar dinding sel seperti kapsul, flagel, pilus.
Di antara bagian tersebut ada yang selalu didapatkan pada sel bakteri, yaitu membran
sel, ribosom dan DNA.Bagian-bagian ini disebut sebagai invarian. Sedangkan bagian-
bagian yang tidak selalu ada pada setiap sel bakteri, misalnya dinding sel, flagel, pilus,
dan kapsul. Bagian-bagian ini disebut varian. Bentuk DNA bakteri seperti kalung yang
tidak berujung pangkal. Bentuk demikian dikenal sebagai DNA sirkuler. DNA tersusun
atas dua utas polinukleotida berpilin. DNA merupakan zat pengontrol sintesis protein
bakteri, dan merupakanzat pembawa sifat atau gen. DNA ini dikenal pula sebagai
kromosom bakteri. DNA bakteri tidak tersebar di dalam sitoplasma, melainkan terdapat
pada daerah tertentu yang disebut daerah inti. Materi genetik inilah yang dikenal
sebagai inti bakteri (Ambarwati, 2016).
Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan hasil isolasi DNA dengan tingkat
kemurnian dan kualitas yang baik. DNA hasil isolasi harus terbebas dari berbagai
kontaminan seperti protein dan RNA yang dapat menggangu berlangsungnya proses
PCR. Oleh karena itu, metode isolasi DNA yang tepat sangat diperlukan untuk
mendapatkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik. Berbagai teknik ekstraksi
DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar sehingga saat ini muncul berbagai teknik
ekstraksi dan purifikasi DNA dalam bentuk kit yang prosesnya akan lebih mudah,
cepat, dan sederhana (Pambudiono et al, 2016). Ekstraksi DNA bisa didapatkan dari
sampel jaringan yang masih segar, beku, dikeringkan atau disimpan dalam alkohol atau
buffer. Proses pengeluaran DNA dengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya
dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstrasi atau bufer lisis untuk
mencegah rusaknya DNA. Isolasi DNA bakteri dimulai dengan melisiskan atau
merusak sel bakteri. Proses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan
memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat (Fatchiyah et al., 2016). Prinsip dasar
isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan
substansi dasar lainnya. Ekstrak sel kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel
yang mengandung DNA/RNA total Isolasi dan digesti kromosom (Darmawati, 2018).
Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode
enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu
dangan cara in-vitro. Empat komponen utama pada proses PCR adalah (i). DNA
cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (ii). oligonukleotida primer,
yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang digunakan
untuk mengawali sintesis rantai DNA, (iii). deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP),
terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan 4 enzim DNA Polimerase, yaitu enzim
yang melakukan katalis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting
adalah senyawa bufferReaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR)
adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dangan cara in-vitro. Empat komponen utama pada proses
PCR adalah (i). DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (ii).
oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15-25 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, (iii).
deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan 4
enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalis reaksi sintesis rantai
DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer.
Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai
temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun
 1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih belum thermostable,
dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain temperature 37°C yang
digunakan bias dan menyebabkan non-specific priming, sehingga menghasilkan
produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri
Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Ensim ini tahan sampai
temperature mendidih 100°C, dan aktifitas maksimal pada temperatur 92-95°C.Proses
PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan
ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik
digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target
dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Amplifikasi menggunakan PCR
dilakukan dengan kondisi sebagaiberikut :denaturasi 94o C selama 2 menit, pada
annealing 55o-68o C selama 30 detik, extension 72o Cselama 2 menit diikuti satu siklus
final ekstensi 72o C selama 5 menit (Hermansyah, et al, 2018).
Selanjutnya adalah amplifikasi produk PCR. Melalui teknik PCR, dapat diketahui
kemampuan amplifikasi primer dan deteksi produk PCR dengan teknik elektroforesis
gel agarosa 1,5%. Proses amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 95°C
selama 15 menit dan diikutioleh 45 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C
selama 1 menit, annealingpada suhu 56°C selama 1 menit 20 detik dan elongasi pada
suhu 72°C selama 2 menit. Proses amplifikasi diakhiri dengan elongasi akhir pada suhu
72°C selama 10 menit.Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa primer pF-inhA dan
pR-inhA telah berhasil mengamplifikasifragmen gen inhA dengan ukuran produk 460
pb (0,4 kb) sesuai dengan hasil analisis secara in silico (Maitriani, 2016). Metode
elektroforesis akan menfidentifikasi suatu zat beradasarkan sifae kelistrikan zat
tersebut khususnya besarnya berat molekul (BM) dan struktur fisik (ukuran) zat
tersebut. Elektroforesis dalam dunia medis digunakan dalam proses pencucian darah,
diagnosis penyakit dan lainnya (Ridwan, 2018).
2. Phase Lock Gel (PLG) menghilangkan kontaminasi protein interfase selama
ekstraksi fenol dan memastikan hasil yang lebih cepat dengan pemulihan yang lebih
baik,Hasil asam nukleat meningkat hingga 30% dibandingkan dengan ekstraksi organik
konvensional, Menghilangkan kontaminasi interfase larutan asam nukleat
Penghalang gel yang stabil memungkinkan penuangan sampel yang mudah
Mengurangi kontak dengan pelarut organik berbahaya

PLG Heavy Aqueous phase: Sampel dengan kepadatan tinggi (misalnya, kandungan
garamnya tinggi).

Fase organik: Campuran standar fenol, kloroform, isoamil alkohol dengan fraksi
kloroform minimal 60% (fenol sebagai satu-satunya pelarut organik tidak kompatibel
dengan PLG Heavy).

PLG Light Fase berair: Sampel densitas rendah

Fase organik: Campuran standar fenol, kloroform, isoamil alkohol.
 PLG bermigrasi untuk membentuk segel rapat antara fase ekstraksi berair/organik
selama sentrifugasi. Fasa organik dan bahan interfase secara efektif terperangkap di
dalam atau di bawah penghalang, sehingga memungkinkan penuangan atau pemipetan
yang lengkap dan mudah dari seluruh fase air. Manfaatnya adalah peningkatan hasil
hingga 30%, peningkatan perlindungan dari paparan senyawa berbahaya, dan tidak ada
risiko kontaminasi sampel interfase. Untuk kenyamanan, PLG disediakan sebelum
dibagikan ke dalam tabung centrifuge standar dengan berbagai ukuran. PLG tersedia
dalam dua formulasi densitas yang berbeda – Berat dan Ringan – dan dapat digunakan
di hampir semua protokol yang memerlukan ekstraksi dengan fenol dan/atau
kloroform, cukup dengan memilih formulasi yang cocok untuk fase organik dan fase
air. xPLG bersifat inert, stabil terhadap panas, dan tidak mengganggu asam nukleat
standar enzim restriksi dan modifikasi. Faktanya, banyak reaksi yang dapat terjadi
dilakukan di hadapan PLG pada suhu yang sesuai dan kemudian diakhiri dengan
ekstraksi dengan Fenol atau Fenol: Kloroform. PLG bisa hadir selama inaktivasi panas
enzim (65 ° C selama 10 menit) sebelum ekstraksi organik. Kemampuan PLG untuk
memisahkan fasa didasarkan pada perbedaan densitas media air dan media organik.
Lapisan organik harus memiliki kepadatan yang lebih tinggi dari PLG dan fase air, dan
PLG harus memiliki kerapatan yang lebih tinggi daripada fase air. Konsentrasi garam
dan protein yang tinggi dalam fase air memiliki efek, setelah dicampur dengan organik,
pada air dan organik kepadatan fase. Formulasi fase organik yang berbeda juga
bervariasi dalam kepadatan. Kapan memilih jenis PLG, komposisi semua komponen
harus diperhatikan pertimbangan. Untuk pemisahan fase yang optimal, komposisi
cairan fase, fase organik, dan PLG harus kompatibel. Akibatnya, PLG ditawarkan di
dua formulasi kepadatan yang berbeda: Ringan (L) dan Berat (H) (Christian, 2016).
 DAFTAR KEPUSTAKAAN

Ambarwati, A. (2016). Uji Aktivitas Antibakteri Isolat Terhadap Salmonella typhosa.

Jurnal Biologi, 1(1), 1-6.
Christian, E. (2016). Optimasi Formuka Sediaan Gel Hand Sanitizer Minyak Atsiri
Jeruk. Fakultas Farmasi Univeritas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Hermansyah, H., Sutami, N., Miksunanti, N. (2018) AMPLIFIKASI PCR DOMAIN
D1/D2 28S rDNA MENGGUNAKAN PRIMER ITS1 DAN ITS4 SAMPEL
DNA DARI Candida tropicalis Y, Indonesian journal of pure and applied
chemistry, 1
Maitriani, L. K. B., Wirajana, I. N., & Yowani, S. C. (2016). Desain Primer untuk
Amplifikasi Fragmen Gen inhA Isolat 134 Multidrug Resistance Tuberculosis
(MDR-TB) dengan Metode Polymerase Chain Reaction. Cakra Kimia
(Indonesia E-Journal of Applied Chemistry), 3(2), 89-96.
Pambudiono, A., Suarsini, E., Amin, M., Pambudiono, A., Suarsini, E., Amin, M., ...
& Malang, U. N. (2016). Isolasi DNA Genom Bakteri Potensial Pengkelat
Logam Berat Kadmium dari Limbah Cair Penapungan Agar. Jurnal Nasional
Pendidikan dan Saintek.
Ridwan, H. (2018). Elektroforesis Analisis Elektronika Terhadap Biokimia Genetika.
Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1), 21-26.