PRAKTIKUM II

Isolasi DNA Genom dari Tanaman Angrek Bulan ( Phalaenopsis amabilis (L.)
Blume)

I. Tujuan
1. Mengetahui teknik isolasi DNA total genom tumbuhan
2. Memperoleh DNA genom murni dari tumbuhan Phalaenopsis
amabilis
II. Dasar teori
DNA (Deoxyribonucleic acid) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA mengandung informasi genetik makhluk
hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam
suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional
maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi
interkromosomal dan ekstrakromosomal (Campbell, 2004).
DNA interkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel.
Sedangkan DNA ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di
sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan
di mitokondria dan kloroplas. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari
DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul
komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Yuwono, 2008).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana.
Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan
dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun
secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk
memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan
penggerusan menggunakan mortar dan pastle. Sedangkan secara kimiawi dapat
dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam
dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel
yang berisi DNA ( Istanti, Annie. 1999).
Secara umum isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan
antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan
presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara,
akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang
berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA
dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah
berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar
air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga
DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit ( Murray,2009).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya
membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-
deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid
memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,
sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia ( Murray,2009). Prinsip prinsip
dalam mengisolasi DNA ( Solomon, 2002) sebagai berikut:
a. Melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
b. Pemecahan dinding sel.
c. Pemecahan membran sel.
d. Pemisahan dna dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan
tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita
lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel. Proses dilakukan secara
mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita
gunakan. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan
pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah
lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini
digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa
keluar ( Solomon, 2002).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin
berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis
alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di
permukaan ( Solomon, 2002). CTAB atau Cetyl trimethylammonium
bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel,
denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan
melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat
keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi. Dalam proses
isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol
dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat
aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam
nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa
quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein ( Solomon, 2002).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak
dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang
mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan
agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian
etanol, pelet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk
mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari
ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresis
berfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak
mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine
Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim
nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena
adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA
dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita
RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).
Di antara jenis anggrek yang terdapat di Indonesia, anggrek
Phalaenopsis merupakan salah satu anggrek kebanggaan nasional. Pada tanggal
5 Juni 1990, anggrek bulan (Phalaenopsis amabilis L.) resmi dinobatkan
sebagai bunga nasional, dengan sebutan Puspa Pesona. Anggrek tersebut
memiliki ciri khas bunga berwarna putih bersih dengan lidah kuning keemasan
(Rukmana, 2000). Phalaenopsis adalah salah satu genus anggrek yang memiliki
kurang lebih 40 60 spesies. Jumlah varietasnya sekitar 140 jenis, 60
diantaranya terdapat di Indonesia. Anggrek bulan (Phalaenopsis amabilis L.)
adalah salah satu spesies dari genus Phalaenopsis yang cukup populer dan
dianggap cukup penting karena peranannya sebagai induk dapat menghasilkan
berbagai keturunan atau hibrida. Keistimewaan lainnya adalah mampu
berbunga sepanjang tahun dengan rata-rata masa berbunga selama satu bulan
(Iswanto, 2001).
Dalam praktikum ini salah satu tujuannya adalah untuk
mengembangkan tanaman angggrek yang unggul dan memiliki niali keindahan
dengan metode embriosomatik. Anggrek merupakan tanaman hias yang bernilai
estetika tinggi dan memiliki arti penting dalam perdagangan bunga. Selain
karena bunganya yang indah dengan warna yang menarik, anggrek dapat
dijadikan sebagai tanaman pot maupun tanaman bunga potong. Tanaman
anggrek merupakan salah satu komoditas tanaman hias yang bernilai ekonomi
tinggi dan sangat prospektif dibudidayakan, sebagai sumber pendapatan
(agribisnis), penyedia lapangan kerja dan penggerak ekonomi di daerah.
III. Alat, Bahan, dan Cara kerja
1. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung konikal 1,5
ml, petridish, timbangan digital, petle dan mortar, waterbath, gyrotary
shaker, sentrifuge, pisau, pinset, sendok kecil, hotplate, dan kamera
digital.
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah 0,3 gr daun
Phalaenopsis amabilis, larutan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide), larutan kloroform, larutan isopropanol, larutan ethanol 70%,
dan larutan 10T-0,1 E.
3. Cara kerja
a. Isolasi total DNA genom tanaman Anggrek
Daun Phalaenopsis amabilis ditimbang seberat 0,3 gr, dimasukkan ke
dalam tabung 1,5 ml. ditambahkan 100l larutan CTAB kemudian Sampel
daun dihaluskan menggunakan pestle dingin hingga hancur kemudian
ditambahkan 400 l larutan CTAB, sampel selanjutnya diinkubasi pada suhu
55-65C selama 30 menit di dalam waterbath lalu ditambahkan sebanyak 500
l larutan kloroform, dicampur dan digoyang pada gyrotary shaker pada suhu
kamar selama 30 menit kemudian tutup microtube sampel dibuka kemudian
disentrifuge 5000 rpm selama 5 menit, lapisan bening ditransfer ke tabung
baru sebanyak 300-400 l kemudian ditambahkan 300-400 l larutan
isopropanol (1:1) dan dicampur dengan inversi lalu didiamkan selama 10
menit pada suhu kamar, selanjutnya sampel disentrifuge selama 5 menit,
supernatant dibuang, lalu pellet DNA dibilas dengan 100 l larutan etanol
70% lalu disentrifugasi 10.000 rpm selama 4 menitlalu supernatant dibuang.
Pelet kemudian dikeringanginkan kemudian diresuspensi DNA dengan 50 l
larutan 10 T-0,1 E dan siap dielektroforesis.
 a. Purifikasi DNA genom tanaman Anggrek
DNA yang diperoleh diresuspensi kemudian ditambah 50 l larutan
fenol kloroform isoamil alcohol (25:24:1) kemudian digoyang dengan shaker
selama 15 menit selanjutnya sampel kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit lalu supernatant dipindah ketabung
baru kemudian sampel kemudian di tambah 10% volume natrium asetat 3M
(pH 5,2) ditambah 2 x total volume ethanol absolut dingin kemudian disimpan
dalam freezer. Sampel disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit kemudian
supernatan dibuang, pellet dicuci dengan ethanol 70% kemudian dikeringkan
lalu DNA diresuspensi dengan 50 l larutan 10nM Tris-HCL 0,1 EDTA (10T-
0,1E) kemudian diambil 2-5 l DNA untuk pengecekan dengan 0,7% gel
agarose elektoforesis

IV. Hasil dan pembahasan

Pada acara praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA genom dari
tumbuhan Anggrek bulan Phaelaenopsis amabilis (L.) Blume. Tujuan dari
isolasi DNA genom adalah untuk memisahkan DNA genom dari bahan lain
seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Genom merupakan keseluruhan DNA
yang dimiliki oleh suatu organisme. DNA yang diperoleh dapat digunakan
untuk berbagai macam kepentingan seperti amplifikasi dan analisis DNA
melalui elektroforesis. Prinsip utama dalam isolasi DNA genom tumbuhan
adalah penghancuran sel (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta purifikasi atau pemurnian DNA.
 A B

Gambar 1. A. Tumbuhan yang digunakan Phaelaenopsis amabilis (L.)

B. setelah dilisis dimasukkan tabung ditambah CTAB (lisis)

Tahapan pertama dalam isolasi DNA adalah proses penghancuran

dinding sel secara mekanik untuk mengeluarkan isi sel. Tahapan ini dapat
dilakukan dengan menngerus daun anggrek dengan pestle dan mortar.
Awalnya ditimbang daun anggrek seberat 0,3gr sampel kemudian
dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5ml dan ditambahkan 100 l larutan
CTAB kemudian dihaluskan dengan pestle dingin, setelah halus ditambahkan
dengan 400 l larutan CTAB. Penambahan CTAB berfungsi untuk melisiskan
membrane sel pada isolasi DNA melalui lisis secara kimiawi. Setelah
penambahan CTAB sampel kemudian diinkubasi dalam waterbath dengan
suhu 55-56C selama 30 menit tujuan inkubasi adalah untuk memberi waktu
CTAB bekerja secara optimal untuk mengurai membrane sel. Setelah itu,
sampel ditambahkan 500 l larutan kloroform, lalu dicampur dan digoyang
pada gyrotary shaker pada suhu kamar selama 30menit.
 A B

Gambar 2. A. Alkohol 70% digunakan untuk membilas pellet untuk purifikasi

B. sentrifus untuk membilas DNA bersama larutan alcohol 70%
C. Hasil awal terbentuk dua lapisan supernatant dan pellet
D. hasil akhir pellet DNA hasil purifikasi yang dikeringanginkan

Penambahan kloroform berfungsi untuk mendenaturasi protein,

kemampuan kloroform untuk mendenaturasi ini berdasarkan kemampuan
rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk diantara fase kloroform dan
air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat
menyebabkan protein mengalami presipitasi, sedangkan lipid dan senyawa
organik lain akan terpisah pada bagian kloroform. Tahap deproteinisasi yang
efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform dan air. Proses ini
dilakukan untuk membentuk emulsi dari air dan kloroform.hal ini dapat
dilakukan dengan sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat
bercampur dengan air sehingga perlu digoyang terus menerus pada gyrotary
shaker pada suhu kamar selama 5 menit.
 Tahapan setelah digoyang pada gyrotary shaker, mikrotube harus
dibuka untuk mengeluarkan gas yang terbentuk selama proses penggojokan,
kemudian disentrifugasi 5000rpm selama 5 menit. Kemudian sebanyak 300-
400 l lapisan bening dipindahkan ke tabung baru. Apabila warna larutan
masih terlihat kehijauan maka perlu dilakukan pengulangan untuk ekstraksi
kloroform. Pada tahap sentrifugasi terjadi pemisahan antara DNA genom
dengan debris sel. Debris sel yang memiliki berat lebih tinggi akan
mengendap menjadi pellet sedangkan DNA genom akan mengapung dalam
supernatant. Sehingga pada tahap ini yang diambil adalah supernatantnya saja.
Kemudian setelah diambil supernatannya, ditambahkan 300-400 l
larutan isopropanol (1:1) kemudian dicampur dengan cara inversi sebanyak 6
kali lalu disiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah didiamkan
selanjutnya sampel disentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit, kemudian
supernatanya dibuang dan akan terlihat pellet DNA berwarna putih pada dasar
tabung. Kemudian pellet dibilas dengan 100 l larutan ethanol 70% lalu
disetrifus lagi 10.000 rpm selama 4 menit kemudian supernatant dibuang.
Fungsi penambahan ethanol atau isopropanol adalah untuk proses presipitasi
yaitu pemekatan DNA. Proses presipitasi memungkinkan DNA pada fase cair
untuk menggumpal membentuk struktur fiber sehingga terbentuk endapan
pelet putih didasar tabung.
Setelah tahap presipitasi selesai dan pellet diperoleh selanjutnya pellet
dikeringanginkan. Setelah kering kemudian diresuspensi dengan
menambahkan 50 l larutan 10 T-0,1 E. setelah tahapan ini selanjutnya adalah
tahapan purifikasi DNA genom, sampel nantinya akan dibagi menjadi dua
yaitu sampel anggrek purifikasi dan sampel anggrek non purifikasi. Setelah
tahapan resuspensi sampel ditambahkan dengan 50 l larutan fenol kloroform
isoamil alcohol (25:24:1) dan selanjutnya digoyang dengan shaker kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, selanjutrnya
supernatan diambil dipindahkan ke tabung baru.
 Selanjutnya sampel anggrek yang dipurifikasi ditambahkan 10%
volume natrium asestat 3M dan ditambahkan 2 x total volume ethanol absolut
dingin kemudian disimpan dalam freezer selama 15 menit. Fungsi
penambahan ethanol absolut dingin adalah sebagai presipitasi sehingga DNA
purifikasi dapat menggumpal. Selanjutnya sampel disentrifugasi 10000rpm
selama 10 menit lalu supernatan dibuang, pellet yang tersisa dibilas dengan
ethanol 70%, kemudian setelah disentrifugasi ethanoil dibuang pellet
dikeringanginkan dan diresuspensi dengan 50 l larutan Tris-HCL 0,1 EDTA
(10T-0,1 E) kemudian dilakukan pengujian elektroforesis.
Tahap selanjutnya adalah preparasi sampel dan loading untuk
pengujian elektroforesis. Pada tahap ini sampel DNA hasil PCR dicampurkan
dengan TBE buffer dan loading dye . Loading dye ditambahkan kedalam
DNA sampel karena berfungsi untuk meningkatkan densitas sampel sehingga
fragmen DNA berada didasar sumuran. Loading dye juga dapat membantu
pergerakan sampel ke anoda. Selain itu loading dye juga berfungsi untuk
penanda adanya pergerakan fragmentasi DNA. Setelah gel agarose jadi gel di
angkat dan diletakkan pada tangki alat elektroporator. Campuran DNA sampel
tadi di masukkan kedalam sumuran pada gel agarose dan langkah selanjutnya
adalah menghidupkan alat elektroporator. Pergerakan fragmentasi DNA akan
bergerak ke arah positif karena DNA bermuatan negatif. Waktu yang
dibutuhkan untuk perambatan fragmen DNA tersebut sekitar 45 menit atau
pergerakan dari fragmen DNA sudah mencapai jarak tempuh 75% dari
panjang agar. Ketika fragmen DNA telah selesai di uraikan maka tahap
selanjutnya adalah visualisasi fragmen DNA menggunakan alat UV
illuminator. Dengan menggunakan alat tersebut maka fragmentasi DNA akan
dapat dengan jelas terlihat.
 A B

Gambar 3. Keterangan
A. pewarna DNA SYBRsafe
B. pemasukan sampel DNA genom dan Loading Dye ke
sumuran agarose
C. alat elektroforator yang terisi gel agarose

Prose elektroforesis menggunakan marker DNA / Sty I. Jumlah total

volume untuk sampel beserta loading dye dan dH2O yang dimasukkan dalam
sumuran adalah 6 l. Sampel dicampur diatas plastic selotip menggunakan
mikropipet proses pencampuran sampel genom anggrek purifikasi dan non
purifikasi dilakukan dengan up and down dengan mikropipet. Setelah siap gel
agarose diletakkan didalam tangki elektroforesis dan ditambahkan larutan
TBE 0,5 x hingga permukaan agarose tertutup larutan kemudian sampel dan
marker dimasukkan ke sumuran agarose dengan mikropipet.
Sebelum dimasukkan sumuran dibersihkan dengan menyemprotkan
TBE 0,5 x dengan mikropipet. Kemudian setelah ditempatkan pada sumuran
 masing-masing, alat elektroforesis diaktifkan untuk proses running DNA
selama 45 menit atau dapat dihentikan apabila DNA telah berjalan duapertiga
bagian gel agarose. Untuk visualisasi pewarnaan DNA menggunakan
SBRYSafe yang lebih aman karena non karsinogen. Lalu hasil elektroforesis
diamati dengan menggunakan UV illuminator dan tampak pita-pita yang
berwarna flouresensi hijau. Berikut adalah hasil elektroforesis DNA Genom
yang telah diisolasi

Gambar. Visualisasi DNA Genom hasil elektroforesis menggunakan UV illuminator

Keterangan: M:Marker sty I; Pa(1): Phaelaenopsis purifikasi K1; Pa(2): Phaelaenopsis non
purifikasi K2; Pa(3) Phaelaenopsis laboratorium; Nt(1): Tembakau K3; Nt(2): Tembakau K4;
Nt(3): tembakau laboratorium; Pa(4): Phaelaenopsis laboratorium encer. Mr sty I: marker
lamda sty I yang diperoleh dari internet

Pada gambar tersebut, sampel DNA genom adalah yang diberi tanda Pa(1)
adalah Phaelaenopsis kelompok 1(purifikasi), pa(2) adalah Phaelaenopsis kelompok
2 (non purifikasi), pa(3) adalah Phaelaenopsis laboratorium, sedangkan Nt(1) adalah
tembakau kelompok 3, Nt(2) adalah tembakau kelompok 4, Nt(3) tembakau
laboratorium, dan Pa(4) adalah Phaelaenopsis laboratorium encer. Berdasarkan hasil
elektroforesis baik pada kelompok satu dan dua, pita terlihat dengan jelas dan dapat
bermigrasi, dapat dibandingkan dengan panjang marker yang ada pada sumuran satu
atau maker Sty I yang diperoleh dari internet sehingga isolasi DNA genom dapat
dikatakan berhasil namun belum sepenuhnya murni karena pada band kedua atau
kelompok Phaelaenopsis kelompok dua terdapat smear yang memiliki panjang lebih
dari marker STY I. Smear ini muncul dapat dikarenakan DNA genom adalah
keseluruhan DNA yang dimiliki organisme tersebut, sehingga dimungkinkan
memiliki polinukeotida yang sangat panjang sehingga menumpuk pada pita atau juga
terdapat ukuran DNA yang bebeda yang menumpuk dan juga terdapat kontaminan
berupa protein atau RNA karena pada praktikum memang tidak ditambahkan
RNAase agar hasil lebih bagus. Jika dibandingkan dengan kelompok tanaman
tembakau maka dapat dilihat smear nya lebih banyak pada kelompok tembakau.
Tebalnya Smear tembakau menunjukan polinukeotida DNA genom tembakau lebih
panjang daripada Phaelaenopsis.

V. Simpulan
Isolasi DNA genom tumbuhan terdiri dari tiga tahap yaitu penghancuran sel (lisis),
pemisahan atau ekstraksi DNA dari bahan padat seperti debris sel, selulosa dan
protein, kemudian purifikasi DNA atau pemurnian DNA. Hasil isolasi DNA genom
sampel Phaelaenopsis amabilis pada kelompok satu dan dua dapat dikatakan berhasil
namun belum sepenuhnya murni karena masih muncul smear pada hasil
elektroforesis yang disebabkan oleh adanya kontaminan pada DNA berupa RNA atau
polinukleotida dengan rantai yang sangat panjang.
 DAFTAR PUSTAKA
Amilah, R.2004.Kultur Jaringan Anggrek. Jakarta: Erlangga.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.UGM.

Campbell, Neil A. Reece, Jane B. dan Can Mitchell. 2010. Biologi Jilid I Edisi
Kedelapan. Erlangga. Jakarta.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Iswanto, H. 2001. Anggrek Phalaenopsis. Jakarta: Agromedia Pustaka.
Murray, Robert K.2009.Biokimia Harper.Jakarta:EGC
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Solomon, E.P, Berg, L.R, Martin, D.W. 2002. Biology. 6th Ed. Brooks/Cole
Thompson Learning. USA.
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
Lampiran
1. Cara kerja
b. Isolasi total DNA genom tanaman Anggrek
Daun Phalaenopsis amabilis ditimbang seberat 0,3 gr, dimasukkan ke
dalam tabung 1,5 ml. ditambahkan 100l larutan CTAB

Sampel daun dihaluskan menggunakan pestle dingin hingga hancur

kemudian ditambahkan 400 l larutan CTAB

Sampel selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-65C selama 30 menit di

dalam waterbath

Ditambahkan sebanyak 500 l larutan kloroform, dicampur dan

digoyang pada gyrotary shaker pada suhu kamar selama 30menit

Tutup microtube sampel dibuka kemudian disentrifuge 5000 rpm

selama 5 menit

Lapisan bening ditransfer ke tabung baru sebanyak 300-400 l

kemudian ditambahkan 300-400 l larutan isopropanol (1:1) dan
dicampur dengan inversi lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu
kamar

Sampel disentrifuge selama 5 menit, supernatant dibuang, lalu pellet

DNA dibilas dengan 100 l larutan etanol 70% lalu disentrifugasi
10.000 rpm selama 4 menitlalu supernatant dibuang.

Pelet kemudian dikeringanginkan kemudian diresuspensi DNA dengan

50 l larutan 10 T-0,1 E dan siap dielektroforesis.
 c. Purifikasi DNA genom tanaman Anggrek

DNA yang diperoleh diresuspensi kemudian ditambah 50 l larutan fenol

kloroform isoamil alcohol (25:24:1) kemudian digoyang dengan shaker
selama 15 menit

Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10

menit lalu supernatant dipindah ketabung baru.

Sampel kemudian di tambah 10% volume natrium asetat 3M (pH 5,2)

ditambah 2 x total volume ethanol absolut dingin kemudian disimpan dalam
freezer

Sampel disentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit kemudian supernatan

dibuang, pellet dicuci dengan ethanol 70% kemudian dikeringkan

DNA diresuspensi dengan 50 l larutan 10nM Tris-HCL 0,1 EDTA (10T-

0,1E)

Diambil 2-5 l DNA untuk pengecekan dengan 0,7% gel agarose

elektoforesis