SELEKSI DAN SCREENING

Seleksi dan screening merupakan hal yang dilakukan setelah tahap transformasi. Seleksi
merupakan tahapan untuk menyeleksi plasmid rekombinan dengan antibiotik. Plasmid
rekombinan yang akan diseleksi harus mencakup salah satu gen antibiotik dibawah ini agar dapat
diseleksi :
Tabel 1. Gen Antibiotik untuk Seleksi pada Plasmid Rekombinan

(Sumber: http://www.blackwellpublishing.com/)

Tujuan dari tahapan seleksi dengan antibiotik ini yaitu agar plasmid rekombinan yang akan
di screening merupakan plasmid yang mengandung DNA rekombinan hasil transformasi
sehingga nantinya plasmid rekombinan yang tidak mengandung DNA rekombinan akan mati
dengan sendirinya karena tidak memiliki zat ampicilin, tetracycline, atau kanamycin.
Screening dilakukan sebagai cara untuk mengetahui keberhasilan transformasi vektor yang
mengandung gen mutan. Jadi, dengan screening kita dapat membedakan antara bakteri host atau
yang sudah dimasuki DNA plasmid dan mana yang tidak. Metode untuk screening merupakan
metode yang sangat spesifik dan sensitif karena hanya sebagian kecil koloni bakteri yang
mengandung sekuens DNA yang diinginkan. Prinsip seleksi ini didasarkan pada selectable
marker yang ada pada vektor. Penggunaan teknik screening bergantung pada vektor atau plasmid
rekombinan yang kita gunakan. Teknik dari skrining pun bermacam-macam diantaranya dalah
white-blue screening, protein assay screening,dan lain-lain.
Pada tulisan kali ini, kami menggunakan blue-white screening sebagai teknik identifikasi
bakteria yang berhasil ditransformasi dan direkombinan di dalam plasmid. Pada dasarnya
skringin putih-biru mendasarkan penyeleksian dengan berdasarkan aktivitas dari enzim Bgalaktosidase yang

ada didalam host sel E.coli, yang dapat menguraikan laktosa menjadi

glukosa dan galaktosa.

Screening biru-putih ini dapat digunakan jika plasmid rekombinan yang akan diteliti
memiliki daerah lacZ operon yang diperlukan dalam proses screening. Daerah pada lacZ ini yang
nantinya menentukan produksi dari enzim B-galaktosidase yang memetabolisme laktosa.
Kebanyakan plasmid rekombinan mempunyai gen lacZ yang dapat mengkode 146 asam amino
pertama dari B-galaktosidase. Host sel E.coli menggunakan sel yang kompeten dan mengandung
mutasi delesi lacZM15. Saat vektor plasmid dihadapkan dengan sel yang memiliki mutasi
delesi seperti itu, akibat dari proses A-complementation, maka enzim B-galaktosidase akan
diproduksi.
Alat yang dibutuhkan untuk melakukan screening bitu-putih diantaranya LB agar,
Ampicillin,

5-bromo-4-chloro-3-inodlyl--D-galactopyranoside

(X-gal)

sebagai

pewarna

histokimia, dan isopropyl-1-thio--D-galactopyranoside (IPTG).

`Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim -galaktosidase, yaitu enzim yang terdiri
dari 2 subunit, yaitu peptida dan peptida . Untuk menjadi suatu enzim yang fungsional, enzim
ini memerlukan kedua peptidanya untuk berikatan dan membentuk enzim yang dapat memecah
substrat laktosa atau X-gal. Gen penyandi peptida biasanya terdapat pada kromosom,
sedangkan gen penyandi peptida terdapat pada plasmid. Bila hanya ada peptida yang
diekspresikan oleh gen pada kromosom, maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau X-gal.
Namun bila terjadi komplementasi oleh peptida , maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh
enzim -galaktosidase yang terbentuk sempurna. Oleh karena itu, komplementasi dapat
membantu untuk proses seleksi biru-putih sebagai indikator keberhasilan kloning atau
transformasi.
`Mekanismenya ialah dengan pBLU (plasmid vector) membawa gen untuk -galactosidase
(lacZ). Enzim ini dapat mendegradasi substrat buatan/pewarna histokimia yang disebut dengan
X-gal yang apabila terdegradasi oleh enzim -galactosidase (lacZ), berubah warna menjadi biru.
Sehingga sel yang menghasilkan -galactosidase akan menjadi warna biru sedangkan sel yang
tidak menghasilkan -galactosidase warnanya putih. Jika insert berhasil disisipkan (diligasikan)
dengan vektor, otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi/rusak dan ujung-ujungnya tidak mampu
menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Sehingga
disimpulkan, koloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal
sajalah yang kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan. Selain itu, digunakan
reagen tambahan yaitu IPTG yang berperan sebagai inducer yang de-represi ekspresi lacZ

(mengaktifkan gennya). Dalam beberapa kasus, tanpa IPTG, -galaktosidase yang dihasilkan
tidak cukup untuk mengubah koloni biru bahkan jika gen lacZ dalam keadaan tidak rusak.
PEMURNIAN PLASMID
Plasmid adalah unsur genetik di luar kromosom (ekstrakromosoma) yang mengadakan replikasi
secara autonom di dalam sel bakteri. DNA-nya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda. Dalam
biologi molekuler, plasmid berperan sebagai carriers atau vectors untuk fragmen DNA spesifik.
Untuk memperbanyak plasmid, kita dapat menggunakan bakteri. Nantinya plasmid itu akan
mendukung gen yang diperlukan baik untuk memproduksi DNA dalam jumlah banyak. Proses
untuk mendapatkan plasmid dari bakteri disebut dengan pemurnian plasmid.
Pemurnian plasmid itu sendiri harus dilakukan dengan mengisolasi zat-zat lainnya yang berada
didalam bakteri seperti kromosom bakteri, protein, membran, dan ribosom bakteri. Metode yang
digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,
alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini
adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.
DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang
berbeda.
Prinsip dari pemurnian plasmid ini dimulai dari kolonial bakteri yang akan ditumbuhkan pada
media kultur yang mengandung antibiotik yang tepat. Dengan adanya gen resistansi antibiotik
dalam plasmid, hanya bakteri yang mengandung plasmid yang dapat tumbuh di media kultur ini.
Bakteri-bakteri ini akan diperbanyak dan terlisis di kondisi pH tinggi. Saat pH netral,
penambahan garam akan dibutuhkan, lalu campuran zat akan menurun kebawah untuk
menghilangkan kotoran dan DNA genom.
Sel lisat yang netral ditambahkan kedalam kolom silika. Plasmid DNA akan menempel pada
kolom dengan mekanisme pertukaran anion, dimana DNA (anion kuat) akan berikatan dengan
kolom bermuatan negatif lewat jembatan garam kation. Zat lain seperti protein akan dicuci atau
terbuang melewati kolom dengan lauran buffer yang tingkat garamnya tinggi. Plasmid murni
akan diperoleh saat larutan buffer kadar garam rendah ditambahkan untuk menghancurkan
jembatan garam. Dalam proses ini, terdapat juga sentrifugasi dimana merupakan teknik untuk

memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai

berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.
Tahapan dalam Pemurnian Plasmid
1. Pemakaian jas lab, sarung tangan dan goggles merupakan step penting yang tidak boleh
dilewati.
2. Kultur bakteri yang ditransformasikan dengan DNA plasmid target harus ditumbuhkan
pada media antibiotik pada 37 C shaking inkubator.
3. Kultur bakteri yang sudah di isolasi dipelletkan dengan sentrifugasi dan lapisan
supernatan dihilangkan. Butiran yang masih ada akan dikembangkan pada larutan buffer
lysis
4. Setelah dikembangkan, bakteri dapat dipindahkan ke tube yang lebih kecil dimana larutan
buffer lysis ditambhakan. Larutan ini memilikia pH yang tinggi dan mengandung
detergen, seperti sodium dodecyl sulfate, dimana akan menghancurkan membran
bakteria, dengan demikian akan melisiskan bakteri. Larutannya akan berubah warna
menjadi keruh karena tambahan dari larutan buffer lysis dan setelah percampuran, larutan
akan menjadi lebih bening. Campuran sebaiknya tidak divortex mengingat kemungkinan
gen DNA yang dapat hancur dan mengkontamminasi pemurnian plasmid DNA
5. Lalu, campuran akan diberikan larutan buffer netral untuk menetralkan kondisi alkaline
dan memperkecil pH. Setelah itu campuran dikocok secara gentle dan lihat perubahan
bahwa gen DNA dan protein akan membuat lapisan diatas tetapi plasmid DNA akan tetap
berada di larutan dibawah. Pada tahap ini, sebaiknya tidak divortex agar plasmid tidak
terkontaminasi dengan gen DNA.
6. Campuran tadi lalu disentrifugasi kembali dan gen DNA/protein dipeletkan. Supernatan
yang mengandung plasmid DNA juga mengandung protein terlarut.
7. Supernatan lalu ditempatken kedalam kolom dengan menuangkannya atau dipipet. Pellet
dapat dibuang

8. Setelah itu, dilanjutkan dengan tahap pencucian dimana menambahkan larutan buffer
garam tinggi untuk menghilangkan endonuklease, RNA, protein, dyes, dan pengotor
molekular yang lain, tetapi DNA masih melekat disilika.
9. Pada stage pencucian akhir, pastikan filter dalam kondisi kering dan tidak ada larutan
buffer yang tersisa. Plasmid DNA masih terdapat di filter.
10. Plasmid DNA akan dielusi dengan air steril atau larutan buffer elusi. DNA akan siap
untuk dipakai selanjutnya.
DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan
spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot
molekul dan muatannya dengan menggunakan

media pemisah. DNA bermuatan negatif

sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA,
serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul. Hasil elektroforesis DNA total akan
menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri yang kemungkinan adalah DNA
plasmid.
DNA Sekuensing
Sekuensing merupakan metode pengurutan basa DNA yang melibatkan produksi seperangkat
molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya, tetapi salah satu ujungnya selalu sama.
Sekuensing dapat dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel. Terdapat dua metode dalam
pengurutan basa yaitu metode Maxam-Gilbert dan metode sanger
-

Metode Maxam-Gilbert
Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah
satu ujjungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau nukleotida pada ujung 5.
Tahapan dalam metode ini:
1. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan
piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan
menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya.
2. Lalu, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. DMS akan
memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan

menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T

sehingga hanya bekerja pada C.
3. Sehingga, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan
ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.
4. Lalu basa akan diurutkan dengan elektroforesis berdasarkan ukuran fragmen
DNA nya.

Metode Sanger
Metode Sanget memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerasi yang
disebut fragmen klenow. Metode ini serupa dengan PCR, hanya saja PCR menggunakan
deoxy-nucleotyde

triphospate(dNTP),

sedangkan

Metode

Sanger

Sequencing

menggunakan dideoxy-Nucleotyde Triphospate(ddNTP). Hasil akhir dari metode ini

yaitu berupa fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang berbeda.

STRATEGI SELEKSI DAN SCREENING

Gambar 1.Plasmid rekombinan yang digunakan

(Sumber: mobitec.com)

SELEKSI ANTIBIOTIK
Pada strategi seleksi kali ini, kami menggunakan seleksi antibiotik untuk menyeleksi
plasmid rekombinan yang sudah mengandung DNA mutagen yang sudah dimodifikasi. Hal ini
dikarenakan plasmid rekombinan pUC 19 memiliki ampicilin yang merupakan salah satu zat
antibiotik untuk proses seleksi. Ampicilin, turunan dari penicilin, memiliki kemampuan untuk
menghambat pembentukan peptidoglikan pada membran sel E.coli. Amipicilin tidak menyerang
sel yang sudah ada tetapi membunuh sel yang membelah untuk membentuk peptidoglikan yang
baru. Biasanya gen ampicilin ini dibawa oleh pUC 19 untuk memproduksi enzim, B-lactamase,
yang berguna dalam proses seleksi antibiotik karena menciptakan suatu ikatan B-lactam ring di
molekul ampicilin. Jika puC 19 diintroduksi dengan plasmid-free antibiotik-sensitive sel bakteri

maka bakteri akan bersifat resistan terhadap ampicilin. Sel yang tidak tertransformasi dan tidak
mengandung pUC 19 makan tidak akan resistan dan pertumbuhan mereka akan terganggu
sehingga menyebabkan kematian.
Selanjutnya, untuk menyeleksi sel mana yang dimasuki vektor yang telah mengandung hasil
transformasi dan mana yang bukan, maka dilakukan seleksi white-blue. Hal ini didasarkan pada
vektor puc18 yang mengandung gen lacZ yang menghasilkan -galactosidase sehingga dapat
memecah X-Gal. Sel inang yang mengandung insert vektor rekombinan iso-1-cytochrome c akan
berwarna putih dan vektor yang tidak mengandung insert iso-1-cytochrome c akan berwarna
biru.
Mekanisme dari screening biru-putih ini yaitu koloni bakteri yang sudah dimutasi akan
ditumbuhkan pada medium selektif yang mengandung ampicilin dan zat kromogenik yang
disebut X-gal. Seperti yang sudah dikatakan sebelumnya, bahwa pUC 19 mengandung gen lacZ
yang akan mengkode 146 asam amino pertama untuk enzim B-galaktosidase. Jika daerah
multiple cloning site sudah dimasuki DNA yang termutasi, maka lacZ akan terganggu dan Nterminal portion dari B-galaktosidase tidak diproduksi. Sehingga substrat X-gal akan tetap
berwarna putih. Hal ini menunjukkan bahwa transformasi plasmid rekombinan berhasil.
Sementara, jika daerah multiple cloning site tidak dimodifikasi maka gen lacZ akan
secara aktif memproduksi enzim B-galaktosidase dan koloni bakteri yang termutasi akan berubah
warna menjadi biru. Hal ini menandakan bahwa transformasi plasmid rekombinan tidak berjalan
dengan tepat atau gagal karena host cell tidak mengandung DNA yang sudah termutasi.
Jadi, dengan teknik screening ini kita dapat mengetahui apakah vektor pUC18 yang telah
disisipi gen iso-1-cytochrome c telah berhasil masuk ke dalam sel inang atau belum dengan
melihat indikasi warna pada medium yang berisi ampisilin dan X-Gal.

Gambar 2. Mekanisme proses screening host cell

(Sumber:blackwellpublishing.com)

MEMASTIKAN BAHWA GOI SUDAH TERMUTASI

Metode Sanger
Dalam hal ini, kami menggunakan sekuensing untuk mengecek kembali urutan basa nukleotida
yang sudah termutasi dengan metode sanger. Metode Sanget memanfaatkan dua sifat salah satu
subunit enzim DNA polimerasi yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah
kemampuannya untuk mensitesis DNA dengan anaknya dNTP dan ketidakmampuannya untuk
membedakan dNTP dengan ddNTP. Tahapan dari metode sanger ini sendiri yaitu sebagai
berikut :
1. Double strand DNA dipisahkan dengan pemanasan sehingga akan terlepas ikatannya
2.
3.
4.
5.
6.

menjadi single strand DNA

dNTPs dan enzim polimerase disiapkan
Primer menempel dan membentuk rantai nukleotida dengan bantuan enzim polimerasi
Pembentukan rantai nukleotida terhenti ketika ddNTP menempel
Terbentuk fragmen-fragmen DNA
Fragmen-fragmen tersebut dielektroforesis untuk mengetahui urutan basanya.

Gambar 3. DNA sequencing

Sumber: www.universe-review.ca