SELEKSI ANTIBIOTIK

Ampicillin memiliki kemampuan

untuk menghambat
pembentukan peptidoglikan
pada membran sel E.coli.
Pada plasmid
pUC 19,
memiliki
ampicilin
dimana memiliki
sifat resistan
atau tahan
terhadap
antibiotik. Hal ini
memungkinkan
kita untuk
melakukan
seleksi dengan
antibiotik

Plasmid rekombinan yang

mengandung ampicilin akan
memproduksi enzim Blactamase yang akan bereaksi
pada antibiotik

Gen Antibiotik untuk Seleksi

pada Plasmid Rekombinan
Antibiotik

Aktivitas

Gen Resistant

Ampicilin

Menghambat
pembentukan dinding
sel dengan
menghancurkan
peptidoglikan

Menghasilkan gen
produk Blactamase(amp) dan
menghidrolisis
ampicilin

Tetracycline

Menghambat
pengikatan aminoacyl
tRNA dengan subunit
ribosom 30S

Adanya produk tet

gene yang mengikat
dan mencegah
akumulasi
tetracycline dengan
mekanisme efflux

Kanamycin

Translasi inaktif
dengan menganggu
fungsi ribosom

Gen neomycin atau

aminoglycoside
phosphotransferase(n
eo) akan menginaktif
kanamycin dengan
fosforilasi

BLUE-WHITE SCREENING
Untuk membedakan nonrekombinan
dari transformasi rekombinan pada
plasmid dapat digunakan screening
blue-white

HOW BLUE-WHITE
SCREENING WORKS?

Koloni bakteri ditumbuhkan pada medium selektif yang

mengandung ampicilin dan zat kromogenik yang disebut Xgal(5-bromo-4-chloro-3indolyl-B-d-galactoside)

pUC 19 menganduk gen lacZ yang akan mengkode 146

asam amino pertama untuk enzim B-galaktosidase.

Jika daerah multiple cloning site dimodifikasi/diinsert DNA,

maka lacZ akan terganggu dan N-terminal portion dari Bgalaktosidase tidak diproduksi sehingga substrat X-gal
tetap
berwarna
putih/colorless
->
menunjukkan
transformasi plasmid rekombinan berhasil

Jika daerah multiple cloning site tidak dimodifikasi maka

gen lacZ akan secara aktif memproduksi enzim Bgalaktosidase dan koloni bakteri akan berubah warna
menjadi biru.

Koloni
putih
mengandu
ng GOI

Sumber:blackwell
publishing.com

HOW to know if the sequence of

mutation goi is right?
Dalam hal ini kita dapat memastikan bahwa GOI yang
sudah dimutasi tertransformasi dengan tepat yaitu dengan
metode sekuensing.

Proses sekuensing adalah untuk

mengecek kembali jika sekuens yang
sudah disisipkan pada plasmid sesuai
dengan sekuens Gene of Interest.

METODE SANGER

METODE SANGER
Sanger DNA Sequencing adalah metode untuk
mengetahui urutan basa dalam suatu fragmen
DNA
Metode ini serupa dengan PCR, hanya saja PCR
menggunakan

deoxy-Nucleotyde

Triphospate

(dNTP), sedangakn Metode Sanger Sequencing

menggunakan

dideoxy-Nucleotyde

Triphospate

(ddNTP)
Hasil akhir berupa fragmen-fragmen DNA dengan

PROSES METODE SANGER