Prof.Dr.

Sumaryati Syukur 1
Pertanyaan: Lihat kloning
Bab 7
1.Isolasi Gen
a.Gen yg mau dikloning,
berapa bp panjangnya dan
primer yg digunakan u reaksi
PCR
b. Total re PCR dan detail
campuran
c. Lihat hsl DNA
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 2
Kloning Gen

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 3
2. Plasmid apa yg digunakan
u kloning dan pemetaan DNA
Plasmid.
3. Rekombinant Plasmid
berapa bp lihat elektroforesis
hsl
4.Host cell E coli……
Kompetent cell, d metoda
transformasi jelaskan
5. Metoda skrining
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 4
Kloning - definisi
 Dari Bahasa Yunani - klon, ranting
 Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan;
kumpulan replika sebagian atau seluruh
makromolekul (contoh, DNA atau
antibodi)
 Suatu individu yang tumbuh dari satu
sel somatik induknya serta memiliki
identitas genetik yang sama dengan
induknya
 Klon: Koleksi molekul atau sel yang
semua identitasnya sama dengan
molekul atau sel penurunnya
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 5
Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau

mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon) yang
dikehendaki dari campuran potongan-
potongan DNA yang kompleks.

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 6
Kloning
Gen
Ketika keseluruhan

DNA dari suatu
organisme
diekstraksi, akan
diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
 Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang
diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 7
Tujuan mengklon
Gen
Menentukan urutan basa nukleotida

penyusun gen tersebut
 Menganalisis atau mengidentifikasi
urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
 Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim
yang disandi gen tersebut
 Mengidentifikasi mutasi yang terjadi
pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
 Merekayasa organisme untuk tujuan
tertentu, misalnya memproduksi
insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 8
Sumber DNA untuk
diklon
 DNA kromosom
 cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA
sebagai cetakan (template)
 DNA yang dihasilkan dari
perbanyakan menggunakan PCR

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 9
Mensintesis cDNA

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 10
Perbanyakan DNA
dengan PCR (Polymerase
Chain Reaction)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 11
 Bahan / Alat untuk
Mengklon
 Enzim endonuklease restriksi
 Enzim ligase
 Vektors
 Inang (Host)
 Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam
sel inang

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 12
Memotong DNA
 Menggunakan enzim
endonuklease restriksi
 Ujung “lengket” (sticky
ends)
 Ujung “tumpul” (blunt
ends)
 Penamaan enzim
 EcoRI
 E = genus (Escherichia)
 co = species (coli)
 R = strain
 I = # of enzyme

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 13
Ujung “lengket” dan
“tumpul”
(Blunt & Sticky ends)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 14
Penyambungan (pasting)
DNA Pembentukan 
ikatan-H pada
ujung-ujung yang
komplemen (sticky
ends)

 Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 15
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 16
Vektor untuk
Mengklon
Diperlukan suatu wahana
(vehicle) untuk
memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel
agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak
di dalam sel tersebut

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 17
 Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal
DNA) yang secara alami dimiliki suatu
jasad
 Bentuknya benang ganda (double strands

DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat

dibuat dengan menambahkan potongan-
potongan DNA lain

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 18
Vektor untuk
Mengklon
Plasmid dapat dimodifikasi untuk
mampu membawa potongan DNA lain ke
dalam sel bila memiliki:
 Replikator (origin of replication)
 Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap

antibiotik)
 Situs untuk mengklon (potongan DNA

yang memiliki urutan basa nukleotida yang

menjadi sasaran enzim restriksi tetapi
tidak terletak di dalam daerah replikator
atau penanda

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 19
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. c

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 20
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 21
Plasmid Khimera (Chimeric
Plasmids)
Khimera berasal dari mitologi Yunani,
makhluk dengan tubuh gabungan dari
bagian-bagian makhluk binatang lain
 Setelah pemotongan plasmid
menggunakan suatu enzim restriksi,
potongan DNA asing yang memiliki ujung
pemotongan yang sama dapat disisipkan
 Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan
DNA asing disambung, akan dihasilkan
"plasmid rekombinan"
 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi
dalam sel inang yang sesuai

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 22
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 23
Kloning Terorientasi
Bila diinginkan untuk
menginsersikan potongan DNA
asing dengan orientasi tertentu
 Dilakukan dengan memotong DNA

vektor maupun DNA sumber gen

yang dikehendaki menggunakan
dua enzim restriksi yang berbeda

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 24
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 25
Vektor untuk
Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial
Chromosome) & YAC (Yeast
Artificial Chromosome)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 26
Vektor berupa
Plasmid
1. Memiliki origin of replication dari
inang yang dituju, sehingga
memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif:
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan
(multiple cloning sites,
Prof.Dr.Sumaryati Syukur MCS) 27
Multiple Cloning Site
(MCS)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 28
Vektor berupa
Plasmid

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 29
 Vektor berupa
 Plasmid
Keunggulan:
 Kecil, mudah pengerjaannya
 Strategi seleksi mudah
 Berguna untuk mengklon potongan
DNA ukuran kecil (< 10kbp)
 Kelemahan:
 Kurang bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA ukuran besar (>
10kbp)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 30
Bakteriofaga (phage)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 31
Vektor berupa bakteriofaga
(vectors)
 Lengan kiri:
 Protein penyusun

kepala & ekor

 Lengan kanan:

 Sintesis DNA

 Pengendalian

 Lisis inang

 Daerah yang

dihilangkan:
 integrasi & eksisi

 Pengendalian

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 32
Vektor berupa bakteriofaga
(vectors)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 33
Vektor berupa
Bakteriofaga
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran
 Kelemahan:
 Lebih sulit pengerjaannya

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 34
 Vektor
Cosmidsifat vektor plasmid dan
Gabungan
sifat berguna dari situs cos
(dihilangkan pada vektor )
 Keunggulan:
 Bermanfaat untuk mengklon
potongan DNA berukuran sangat
besar (32 - 47 kbp)
 Seleksi berdasar ukuran

 Pengerjaan seperti plasmid

 Kelemahan:
 Tidak terlalu mudah untuk
mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 35
Vektor
Cosmid

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 36
 ZAP

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 37
Vektor BAC
 Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
 parA and parB
mengendalikan
agar hanya
terdapat satu
vektor dalam sel
 Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 38
Vecktor YAC
large
inserts

ARS URA3 HIS3

telomere centromere markers telomere
replication
origin

 Dapat disisipi gen asing 200 - 2000

kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 39
BACs dan
YACs
BACs : Bacterial Artificial
Chromosomes
YACs : Yeast Artificial
 Keunggulan:
Chromosomes
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA


dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)

 Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan
basa nukleotida total genom
 Kelemahan:
 Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan
ukuran sangat besar

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 40
 Shuttle Vector
 Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam
inang (memiliki origin of replication dari masing-
masing inang)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 41
Memilih Vektor
 Ukuran DNA yang
disisipkan
 Ukuran vektor
 Situs enzim
restriksi yang
tersedia
 Jumlah salinan
(copy number)
 Efisiensi kloning
 Kemampuan untuk
menapis DNA
sisipan
 Rencana penelitian
selanjutnya
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 42
 Cara Mengklon DNA (1)
 Isolasi vektor kloning
(plasmid bacterial) & DNA
sumber gen
 Pemotongan DNA sumber
gen & vektor kloning
menggunakan enzim
restriksi yang sama
 Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam
vektor kloning yang telah
dipotong menggunakan
enzim restriksi yang sama;
potongan disambung
dengan bantuan enzim
DNA ligase

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 43
 Cara Mengklon DNA (2)
 Vektor kloning yang
telah tersisipi
potongan DNA
dimasukkan ke dalam
sel inang (transformasi
sel inang)
 Penapisan sel
pengklon (dan gen
yang dimasukkan)
 Identifikasi sel
pengklon pembawa
gen yang dikehendaki

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 44
Transformasi Sel Inang

Memasukkan plasmid (yang

merupakan vektor yang telah
disisipi gen) ke dalam sel
inang

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 45
Transformasi (1)
 PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif
kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan
ini memberikan cekaman kepada
bakteri yang mengakibatkan
membran sel dan dinding sel
bakteri tersebut menjadi
permeabel terhadap plasmid donor.
Proses ini mengakibatkan E. coli
menjadi “kompeten" untuk
menerima plasmid .
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 46
Transformasi (2)
 INKUBASI
 Plasmid ditambahkan ke dalam
suspensi sel E. coli kompeten.
 Suspensi sel E. coli kompeten
lainnya yang tidak ditambah
plasmid digunakan sebagai kontrol.

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 47
Transformasi (3)
 KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun kontrol)
dipaparkan sejenak (90 detik)
kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya
plasmid menembus membran dan
dinding sel.

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 48
Transformasi (4)
 PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun kontrol)
ditumbuhkan dalam medium kaya
nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami
cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung
satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)
Prof.Dr.Sumaryati Syukur 49
Transformasi (5)
 PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah
mengalami penyembuhan ditapis
pada medium padat yang
mengandung senyawa penapis
berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 50
Koloni E. coli yang
membawa plasmid dengan
penanda gen pendar fluor
(pGLO)

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 51
E. coli yang Membawa
Plasmid pGlo

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 52
Penanda selektif
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing
 ketahanan terhadap antibiotik
ganda
 penapisan biru-putih

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 53
 Penapisan Klon
 Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang
digunakan sebagai
penanda, misalnya
Kanamisin
 Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid
dengan penanda
ketahanan terhadap
Kanamisin(Kanr), yang
di sebelah kiri tidak
memilikinya

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 54
Penapisan warna koloni
Biru/Putih
lacZ lacZ insert

Enzim berfungsi Enzim tidak

berfungsi
X-gal produ X-gal produk
k

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 55
Penapisan Koloni Bakteri
pembawa Plasmid
Rekombinan

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 56
 Hibridisasi Koloni

 Dapat
dilakukan jika
memiliki DNA
pelacak
 Bagian dari
gen yang
dikehendaki
 Bagian dari
gen yang mirip
dari jasad lain
 Oligonukleotid
a sintetik

Prof.Dr.Sumaryati Syukur 57