Rejeki Siti Ferniah

Definisi :
Adalah teknik pembentukan rekombinan baru dari
material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul
asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel )
sehingga memungkinkan penggabungan dan kelanjutan
berkembang/diperbanyak di dalam sel inang yang baru.
KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara
genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang
telah disisipkan, dan memperbanyak molekul yang baru
tersebut.
 rekayasa genetika = teknologi DNA rekombinan
 Cloning is the making of many copies of a segment of DNA
 Cloning vectors range from plasmids to artificial chromosomes to
viruses
 Genomic libraries are collections of clones that contain at least one
copy of every DNA sequence in an organism’s genome
 cDNA made from mRNA represent eukaryotic genes without introns
 Identification of clones can be done using cDNA probes, antibodies,
complementation of mutations, and sequencing
 The PCR is a procedure for amplifying a specific segment of DNA
 What are the 3 general steps used to clone DNA?
 Isolate DNA from an organism
 Cut the organismal DNA and the vector with restriction enzymes making
recombinant DNA
 Introduce the recombinant DNA into a host

 Restriction Enzymes
 Recognize a specific site (generally a pallidromic sequence)
 Produce overhangs or straight cuts
 Naturally found in bacteria, they protect against viruses and foreign DNA
 More than 400 enzymes have been isolated
 Named for the organism they from which they are isolated
▪ The first letter is that of the genus and the 2nd and 3rd are from the species
 Pembentukan DNA rekombinan:
Tanpa Vektor : mikroinjeksi, bom
mikropartikel.
Dengan Vektor.
 Vektor : wahana/kendaraan yang membawa
suatu gen asing masuk ke dalam sel inang.
 Macam-macam vektor :
plasmid, bakteriofag, cosmid, BAC’s, YAC’s.
 Plasmid : DNA sirkuler di sitosol di luar
kromosom. Umumnya ada di bakteri, jarang di
yeast.

 Plasmid yang dapat berintegrasi dengan

kromosom bakteri : episom  replikasi
mengikuti replikasi kromosom.
1. Replikasi mandiri lepas
dari kromosom.

2. Replikasi mengikuti
replikasi kromosom.
 Syarat-syarat plasmid sbg vektor kloning :
1. Berukuran kecil.
2. Mempunyai penanda spesifik (selectable
marker).
3. Mempunyai satu/lebih sisi restriksi unik.
4. Mempunyai titik awal replikasi (ORI) atau
mampu melakukan replikasi mandiri dalam
sel inang.
 Keuntungan menggunakan plasmid kecil sbg
vektor :
1. Mudah ditangani/direkayasa.
2. Mudah diisolasi dari sel inang.
3. Lebih resisten thd kerusakan fisik.
4. Terdapat dalam banyak salinan.
 Plasmid alami : plasmid yang belum mengalami
perubahan struktur atau belum direkayasa DNA-
nya.
Contoh : plasmid Col E1 dari E. coli.
 Plasmid kloning pada umumnya merupakan
plasmid artifisial, yaitu plasmid yang sudah
direkayasa.
Contoh : pBR322 (Bolifar, 1977).
 mempunyai 1 ORI
 penanda : amp R dan tet R
 sisi unik : Pst1 di amp R , BamH1, HindIII, Sal1 di tetR.
 Restriction map plasmid
pUC18/19

Multiple Cloning Sites

pUC18

pUC19
1. Plasmid F : plasmid fertilitas, mampu membentuk fili
untuk memindahkan DNA melalui konjugasi.
2. Plasmid R : plasmid resistensi, membawa penanda
resistensi thd satu/lebih antibiotik.
3. Plasmid Col : plasmid penghasil colisin, suatu protein
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain.
4. Plasmid degradatif : plasmid yang menghasilkan
enzim-enzim degradatif yang dapat memecah
berbagai senyawa organik, mis. pWWO pada P.putida
mampu memetabolisasi toluen dan asam salisilat.
5. Plasmid virulensi : plasmid yang menyebabkan sel
inang menjadi virulen thd patogen. Plasmid Ti dari
A.tumefaciens menyebabkan induksi tumor.
 DNA yang dapat
disisipkan melalui
plasmid : 10 kb.
Bakteriofag (fage) : virus yang menginfeksi
bakteri.

Keuntungan menggunakan fage sbg vektor :

1. Strukturnya sangat sederhana, hanya seutas
DNA/RNA.
2. Mampu menyisipkan DNA asing sampai 23
kb.
1. Fage litik : fage yang tidak berintegrasi
dengan kromosom bakteri.
2. Fage lisogenik : fage berintegrasi dg krom.
Bakteri.
1. Fage λ
Struktur kepala – ekor.
Ukuran DNA 49 kb.
Bentuk DNA : heliks
ganda, sirkuler atau
linier.
Mempunyai ‘cos site’ :
ujung-ujung DNA linier
yang saling
komplementer jika
melingkar  uj. lengket.
2. Fage M13
 Berbentuk rantai.
 Bentuk DNA sirkuler
untai tunggal, ukuran
6407 nuk.
 Keistimewaan M13 sbg
vektor:
 ukuran genomnya kecil
 bentuk replikatif DNA-nya
mirip dengan plasmid
 preparasinya mudah
 gen yang diklon dengan M13
dapat diperoleh dalam
bentuk untai tunggal.
 Mekanisme injeksi M13: melalui fili.
 Sintesis DNA komplementer berlangsung
dalam sel bakteri.
 Replikasi > 100 salinan tanpa mengganggu
kromosom bakteri.
 Cosmid : (cos : mempunyai sisi cos λ, mid :
plasmid) Molekul DNA sirkuler kecil (4 – 6 kb)
yang mengandung ujung linear DNA λ, ORI
plasmid, dan beberapa sisi unik restriksi.
 DNA yang dapat dibawa : 46 kb.
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes :
plasmid F yang direkayasa untuk membawa
DNA asing > 300 kb.
Contoh : pBAC108L
 mempunyai gen regulator yang dapat mengatur
replikasi (ori S dan rep E) dan jumlah salinan (parA
dan parB)
 mempunyai penanda CMR
 mempunyai sisi unik restriksi HindIII dan BamHI
 istimewa : ada sisi NotI dan SfiI yang mempunyai
sisi pemotongan 8 nuk.
YACs : Yeast Artificial Chromosomes : suatu
DNA yang bereplikasi seperti plasmid
tetapi menjadi seperti kromosom yeast jika
mengandung DNA asing.
 Mempunyai ORI, penanda, dan sisi unik
restriksi seperti plasmid.
 Mempunyai 1 sentromer dan 2 telomer
yeast.
 DNA yang dapat dibawa : 500 kb.