Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup[1].

Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut[1]. Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang. [1]

Struktur plasmid [sunting]

Sebagian besar plasmid memiliki struktur sirkuler, namun ada juga plasmid linear yang dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu, seperti Borrelia burgdorferi dan Streptomyces.[2] Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas ganda yang sebagian besar tersusun menjadi superkoil atau kumparan terpilin.[3] Struktur superkoil terjadi karena enzim topoisomerase membuat sebagian DNA utas ganda lepas (tidak terikat) selama replikasi plasmid berlangsung.[3] Struktur superkoil akan menyebabkan DNA plasmid berada dalam konformasi yang disebut lingkaran tertutup kovalen atau covalently closed circular (ccc), namun apabila kedua utas DNA terlepas maka akan plasmid akan kembali dalam keadaan normal (tidak terpilin) dan konformasi tersebut disebut sebagai open circuler (oc).[3]

Sejarah plasmid [sunting]

Penemuan akan plasmid telah dimulai sejak tahun 1887, ketika Robert Koch mempublikasikan penelitiannya tentang bakteri Bacillus anthracis sebagai penyebab penyakit antraks.[4] Sekitar 100 tahun kemudian, para ilmuwan menemukan bahwa bakteri tersebut memiliki 2 plasmid yang merupakan faktor virulensi penyebab antraks.[4] Keyakinan akan keberadaan DNA plasmid berhasil dibuktikan oleh J. Lederberg dan dan W. Hayes pada tahun 1950-an.[4] Kedua ilmuwan tersebut berhasil menyelidiki tentang peristiwa konjugasi pada Escherichia coli yang melibatkan plasmid.[4] Tidak beberapa lama setelah itu, plasmid terbukti merupakan DNA ekstrakromosomal yang menyebabkan resistensi antibiotik pada golongan bakteri enterik dan dapat ditransmisikan antarsel [4]. Sejak saat itu, beberapa laboratorium mulai membuat plasmid yang dapat ditransfer ke sel hidup, seperti sel bakteri dan tanaman. [4]

Fungsi plasmid [sunting]

Dewasa ini, plasmid telah diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan untuk digunakan sebagai vektor kloning[5]. Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa

kriteria, yaitu berukuran kecil, relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi ( high copy number), memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs pemotongan enzim restriksi untu memudahkan penyisipan DNA ke dalam vektor plasmid[5].

Penamaan plasmid [sunting]

Pada awalnya penamaan plasmid didasarkan pada sifat fenotipe yang dikodekan oleh DNA plasmid tersebut.[6] Contohnya plasmid ColE1 yang berasal dari E. coli dapat menyandikanbakteriocin colicin.
[6]

Banyaknya laboratorium ataupun institusi yang membuat plasmid kloning membuat sistem penamaan

tersebut berubah. Untuk standardisasi penulisan plasmid, digunakan huruf "p" yang diikuti oleh inisial huruf kapital dan angka[6]. Huruf kapital diambil dari nama institusi atau laboratorium tempat plasmid tersebut berasal ataupun dari nama penemu plasmid tersebut [6]. Sedangkan, angka yang ada merupakan kode antara dua laboratorium tempat plasmid tersebut dibuat [6]. Contohnya: pBR322, "p" menyatakan plasmid, BR merupakan laboratoriumtempat plasmid tersebut pertama kali dikonstruksi (BR dari Bolivar dan Rodriguez, perancang plasmid tersebut), sedangkan 322 menyatakan di laboratorium mana plasmid ini dibuat, banyak pBR lainnya seperti pBR325, pBR327, dll. [6]

Mekanisme mencegah pembuangan plasmid [sunting]

Untuk mencegah pembuang plasmid dari sel yang tidak lagi membutuhkannya, terdapat beberapa mekanisme yang sudah diketahui.[4] Salah satunya adalah beberapa plasmid menyandikan protein yang dapat membunuh sel yang membuangnya.[4] Mekanisme ini disebut ketergantungan plasmid (plasmid addiction) yang diklasifikasikan menjadi tiga jenis berdasarkan aksi yang dilakukan protein antitoksin yang disandikan plasmid.[4] Ketiga jenis aksi tersebut adalah berinteraksi dengan toksin, melindungi target yang akan diserang toksin, dan menghambat ekspresi toksin tersebut. [4]

http://id.wikipedia.org/wiki/Plasmid

Seleksi Pada bagian ini kami memberikan gambaran mengenai prinsip-prinsip umum yang dipakai dalam prosedur seleksi dan penepisan rekombinan, dengan subbab mengenai metode genetik, imunokimia, south-westrem, hibridisasi asam nukleat dan rekombinasional. 1) Metode genetik Seleksi untuk adanya vektor. Apabila digabungkan dengan teknik-teknik mikrobiologis, seleksi genetik merupakan alat yang sangat canggih karena dapat diterapkan pada populasi yang besar. Semua molekul vektor yang bermanfaat membawa suatu penanda atau ciri genetik yang dapat diseleksi. Vektor-vektor plasmid dan kosmid membawa penanda resistanobat atau nutrisional, dan dalam hal pembentukan plak vektor-vektor fag itu merupakan ciri yang terseleksi. Seleksi genetis terhadap keberadaan vektor merupakan langkah persyaratan untuk memeperoleh populasi rekombinan. Seperti telah kita lihat, hal ini dapat dilaksanakan untuk membedakan molekul rekombinan dengan vektor parental non-rekombinan.

Pennyisipan penanda resistan-obat yang ditidakaktifkan, atau dari suatu gen. Dengan suatu vektor lambda tipe pengganti tertentu, dan dengan vektor-vektor kosmid, seleksi ukuran berdasarkan partikel fag menyeleksi pembentukan rekombinan. Seleksi urutan sisipan. Apabila suatu gen asing yang disisipkan pada rekombinan yang diinginkan itu terekspresikan, maka seleksi genetik mungkin memberikan metode yang paling sederhana untuk mmemisahkan klon-klon yang mengandung gen tersebut. Fragmenfragmen DNA E. Coli terklon yang membawa gen-gen biosintesis dapat diidentifikasi melalui komplementasi dari mutasi auksotrof yangg tidak dapat dibalik pada inang galur E. Coli. 2) Metode imunokimia Deteksi klon yang mensintesis protein asing secara imunokimia merupakan contohcontoh yang berhasil di mana urutan gen yang disisipkan terekspresi. Keuntungan utama metode ini adalah bahwa gen-gen yang tidak memberikan sifat apa pun yang dapat diseleksi pada inang juga dapat dideteksi, tetapi tenntu saja ini membutuhkan antibodi khusus. Metode Broome dan Gilbert (1978) akan membantu menjelaskan metode deteksi imunokimia. Ada tiga butir: 1. Suatu serum kekebalan yang mengandung beberapa tipe IgG yang berikatan pada determinan yang berbeda pada molekul antigen 2. Molekul antibodi sangat kuat menyerap plastikk seperti polivinil yang tidak dapat dibuang dengan cara mencuci 3. Antibodi IgG dapat ditandai radioaktif dengan mudah yaitu dengan iodinasi secara invitro Sifat-sifat ini secara bagus sekali dimanfaatkan dengan cara berikut. Pertama, sel-sel yang sudah ditransformasi dikultur lempeng pada agar ddalam cawan petri biasa. Suatu lempeng replika juga harus disiapkan karena prosedur selanjutnya membunuh kolonikoloni ini. Kemudian koloni bakteri disisipkan dengan beberapa cara melalui pembedahan pada uap kloroform, melalui penyemprotan dengan suatu aerosol fag virusen, atau dengan menggunakan bakteri inang yang membawa profag yang termoindusibel. Perlakuan ini membebaskan antigen dari koloni positif. Suatu lembaran polivinil yang telah dilapisi dengan antibodi yang tepat (tidak bertanda) dikenakan pada permukaan lempeng, dengan di atasnya antigen membentuk kompleks dengan IgG yang terikat. Lembaran ini diambil dan didedahkan pada IgG yang ditanddai I125 . IgG-I125 itu dapat bereaksi dengan antigen terikat melalui determinan antigenik pada tapak-tapak selain tapak yang terlibat dengan pengikatan awal antigen pada lembar berlapis IgG. Koloni-koloni yang bereaksi positif dideteksi melalui pencucian lembar dan pembuatan cetak autorradiografik. Klon-klon yang dibutuhkan kemudian dapat diperoleh kembali dari lempeng replika. Metode ini dapat diterapkan dengan sedikit modifikasi saja pada lempeng yang mengandung plak-plak fag sebagai pengganti koloni yang sudah ditransformasi. Dua aspek metode imunokimia yang lebih lanjut juga perlu disebutkan. Pertama, pendeteksi molekul protein yang sudah berubah dimungkinkan apabila perubahan itu tidak mencegah reaksi silang dengan antibodi. Kedua, metode deteksi dua-tapak untuk mendeteksi penyusun genetis yang baru. 3. metode rekombinasi

Metode yang sederhana dan sangat kuat ini didasarkan pada rekombinasi homolog pada inang E.coli. urutan gamak di sini disisipkan ke dalam suatu vektor plasmid yang dibentuk secara khhusus VX. Ini merupakan suatu plasmid yang sangat kecil, terdiri dari 902 pasangan basa yang diturunkan dari replikon CoI EI, yang mengandung suatu urutan poli-pemaut yang cocok dan suatu gen supresor tRNA, sup F. Kepustakaan genomik fag dibiakkan pada E.coli yang muddah mengalami rekombinasi yang mengandung plasmid rekoombinan gamak- VX. Fag yang membawa urutan yang homolog dengan gamak akan memperoleh suatu kopi terintegrasi dari plasmid melalui rekombinasi homolog. Fag yang membawa gamak- VX terintegrasi ini kemudian dapat diperoleh kembali dan dipisahkan dengan cara menumbuhkannya dalam kondisi terpilih yang cocok. Akhirnya dengan membuat kultur lempeng pada suatu E.coli yang tidak tertekan hanya fag-fag yang memiliki gen terintegrasi sup F yang dapat membentuk plak karena sifatnya yang homolog dengan gamak. Metode ini dapat diterapkan dengan mudah pada sejumlah sangat besar fag dalam kepustakaan genomik, dan memiliki keuntungan dalam hal dapatnya dilakukan dengan sangat cepat asalkan plasmid rekombinan gamak- VX-nya telah tersusun seebelumnya. Segmen gamak terpendek yang dapat memberi rekombinasi yang tinggi diketahui panjangnya sekitar 60 passangan basa. Sejumlah tertentu divergensi urutan dapat ditolelir dalam peristiwa rekombinasi homolog, tetapi telah ditunjukkan bahwa gamak ini membedakan antara urutan yang homoolog sempurna dengan divergensi urutan sebesar 8,2%. 4. metode south-westerm Metode ini melibatkan suatu membran nitro-selulose angkat-plak tempat pengadsobsian protein fusi yang teerekspresi. Prosedur untuk melaksanakan angkat-plak sama dengan prosedur yang baru diekspresikan. Walaupun demikian, penapisan dilakukan dengan menginkubasi membran dengan suatu oligonukleotida khusus. Kondisi dipilih sehingga dapat diminimalkan pengikatan tidak khas. Plak yang bereaksi positif diidentifikasi dengan autoradiograf filter. Karena itu teknik ini menggunakan DNA bertanda radioaktif untuk mendeteksi polopeptida pada nitroselulose dan disebut prosedur suoth-westerm. Metode ini sangat berhasil untuk memisahkan klon-klon yang mengekspresikan urutan cDNA yang berkaitang dengan faktor transkripsi tertentu pada mamalia. Jelaslah bahwa prosedur ini hanya berhasil: Apabila kegiatan pengikatan disebabkan oleh satu rantai polipeptida tunggal Apabila ini dapat diekspresikan dalam bentuk fungsional ketika dalam polipeptida fusi

5. Metode hibridisasi asam nukleat Berbagai macam metode deduksi rekombinan yang menggunakan hibridisasi dengan DNA yang dipisahkan dan dimurnikan dari sel-sel yang mengalami transformasi telah berhasil dikembangkan. Koloni yang akan ditapis pertama-tama dibuat lempeng replikanya pada suatu cakram filter selulosa nitrat yang telah ditempatkan pada permukaan suatu lempeng agar sebelum dilakukan inokulasi. Suatu set referensi dari koloni-koloni ini akan diperoleh pada lempeng induk. Filter yang membawa koloni-koloni ini diambil dan diperlakukan dengan alkali sehingga koloni-koloni bakterinya mengalami lisis dan DNA-nya terdenaturasi. Filter ini kemudian diperlakukan denggan proteinase K untuk menghilangkan proteinnya dan

meninggalkan DNA terdenaturasi terikat pada selulosa nitrat karena afinitasnya yang tinggi dengan selulosa nitrat, dalam bentuk suatu cetak-DNA dari koloni-koloni. DNA itu terikat kuat dengan cara memanaskan fiilternya pada suhu 80C. RNA yang telah tertentu dan bertanda dihibridisasikan dengan DNA ini dan hasil hibridisasinya dipantau melalui autoradiografi. Suatu koloni yang cetak DNA-nya memberikan hasil autoradiografi yang positif kemudian dapat diambil dari lempeng referensi. Variasi dari prosedur ini dapat diterapkan pada plak-plak fag. Metode ini filter selulosa nitratnya diterapkan pada permukaan atas lempeng agar, sehingga membentuk kontak langsung antara plak dan filter. Plak-plak berisipartikel fag dan sejumlah besar rekombinan DNA yang tidak terpaket. Keduanya yaitu fag dan DNA tidak terpaket terikat pada filter dan dapat didenaturasi, difiksasi, dihibridisasi, dan sebagainya. Metode ini merupakann prosedur angkat-plak yang asli dan memiliki keuntungan dalam hal dapat dibentuknya dengan mudah beberapa cetak DNA yang identik dari satu lempeng tunggal fag. Hal ini memungkinkan dilakukannya penapisan dalam keadaan ganda, dan karenanya meningkatkan reliabilitasnya, dan juga memungkinkan sattu set tunggal rekombinan dapat ditapis dengan dua gamak atau lebih. Keuntungan terbesar dari metode hibridisasi adalah sifatnya yang umum. Dapat diterapkan dalam urutan apapun, asalkan tersedia gamak radioaktifnya yang tepat.
http://ariernawati20110329.blogspot.com/2011/03/kloning-pada-bakteri-ecoli.html