No 10

https://www.youtube.com/watch?v=bNv79OvVxYY

https://www.youtube.com/watch?v=rpLSvEbOmqc
Pengertian Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan suatu enzim yang berasal dari mikroba yang bisa
memotong sekuens atau urutan DNA untai ganda. Enzim restriksi ini memiliki
nama lain yaitu endonuklease restriksi. Enzim ini bekerja dengan memotong
sekuens DNA secara spesifik dengan memotong 4 sampai dengan 6
pasangan basa. Enzim restriksi ini memotong sekuens DNA pada rangka gula
fosfatnya tanpa merusak susunan basa nitrogennya.

Fungsi Enzim Restriksi

Enzim restriksi memiliki fungsi yang berlawanan dari polimerase, ini
dikarenakan mereka menghidrolisis atau memutus ikatan ester dalam ikatan
fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan dengan rantai nukleotida.

Dalam biologi molekuler dan rekayasa genetika, mereka banyak digunakan

alat untuk konstruksi ekspresi dan vektor kloning, dan untuk identifikasi urutan
tertentu. Mereka juga berguna untuk pembangunan genom rekombinan dan
mempunyai potensi bioteknologi yang besar.
Kemajuan terbaru dalam terapi gen saat ini menggunakan enzim restriksi
untuk memasukkan gen tertentu ke dalam vektor yang merupakan kendaraan
untuk membawa gen tersebut ke sel hidup, dan yang mungkin mempunyai
kemampuan untuk dimasukkan ke dalam genom sel untuk melakukan
perubahan permanen.

Jenis – Jenis Enzim Restriksi

Enzim restriksi secara tradisional dibedakanmenjadi 3 tipe berdasarkan
komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang
dibutuhkan, yaitu :

 Enzim restriksi tipe I

Enzim restriksi ini kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara

acak dan jauh dari sekuens pengenalannya.Mulanya enzim ini dikira langka,
namun sesudah analisis sekuens genom, enzim ini ternyata umum. Enzim
restriksi tipe I ini mempunyai pengaruh besar dalam biokimia, namun memiliki
nilai ekonomis yang rendah sebab tidak dapat memproduksi potongan
fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.

 Enzim restriksi tipe II

Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini
memproduksi fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan maka biasa
digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen.

Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI;
dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim ini termasuk kecil
dengan subunit yang mempunyai 200-350 asam amino dan memerlukan
Mg2+ sebagi kofaktor.

Lalu enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs,
adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong di luar situs pengenalan, memiliki
ukuran yang sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus.
Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang
satunya untuk memotong DNA.

 Enzim restriksi tipe III

Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan
dalam laboratorium. Hal ini disebabkan enzim ini memotong di luar situs
pengenalan dan memerlukan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada
DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang
memproduksi potongan sempurna.

Mekanisme Kerja Enzim Restriksi

Enzim restriksi memotong DNA dalam 2 cara dan hasil yang berbeda, yaitu:

1. Hasil pemotongan berujung tumpul (blunt atau flush end)

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA maka
menciptakan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini
ialah SmaI

2. Hasil pemotongan berujung lancip atau lengket (sticky atau cohesive

ends)

Pola seperti ini lebih mudah melekat (annealing) dengan pasangan DNA nya
sebab adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.

 Ujung menggantung 5’ : Enzim ini memotong secara asimetris pada

situs pemotongan, memproduksi hasil pemotongan memanjang pada
ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ ialah
BamHI
 Ujung menggantung 3’, Enzim ini juga memotong secara asimetris pada
situs pengenalan, tetapi menciptakan hasil pemotongan memanjang
pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini ialah
KpnI.

Memotong Dan Menyambung DNA
Pemotongan gen dalam satu untaian DNA menggunakan enzim
endonuklease restriksi. Enzim ini berperan sebagai gunting biologi.

DNA insert donor dari suatu organisme bisa diisolasi dengan memotongnya
menjadi segmen- segmen kecil dengan menggunakan enzim endonuklease
restriks. Bagian Segmen DNA yang didapat, kemudian dimasukkan dalam
suatu vektor.

Vektor ini harus mampu berikatan dengan DNA insert donor, memperbanyak
diri, dan mengekspresikan gen tersebut. Vektor (organisme pembawa) pada
proses ini ialah plasmid atau virus.

Plasmid merupakan rantai DNA melingkar di luar kromosom bakteri. DNA

Plasmid maupun DNA virus harus dipotong terlebih dahulu sebelum dapat
digunakan sebagai vektor.

Enzim yang digunakan ialah sama dengan enzim untuk memotong DNA Insert
donor yang dikehendaki. Pemotongan ini menggunakan enzim endonuklease
restriksi.

DNA insert Donor yang sudah diisolasi dan dipotong lalu dicangkokkan ke
dalam plasmid vector. Proses pencangkokan ini dikenal dengan sebutan
transplantasi gen atau DNA. Transplantasi dilakukan dengan cara
mencangkokkan (atau menyambung) DNA insert donor yang telah diisolasi ke
dalam DNA plasmid vector.

Penyambungan gen tersebut menggunakan enzim ligase yang sanggup

menyambungkan ujung- ujung nukleotida. Enzim ligase berfungsi sebagai lem
biologi. Sesudah proses penyambungan ini, maka plasmid vektor
mengandung DNA asli dan DNA sisipan (asing).

Dengan begitu, diperolehlah organisme baru yang mempunyai rantai DNA

gabungan atau kombinasi baru. Rantai DNA gabungan atau kombinasi baru
ini disebut DNA rekombinan.

Struktur Enzim Restriksi

Struktur enzim restriksi BamHI yang mengikat DNA. Enzim tersebut
mengenali double strand dari DNA dengan sekuens spesifik 5′-GGATCC-3′,
yang kemudian memecah ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya
ialah berupa dua fragmen yang ujungnya sticky ends.

Enzim BamHI ini mempunyai kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam
prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation
bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid
yang diperlukan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003;
Reece, 2004).

Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester

pada urutan DNA pada sisi:
5′ G↓G-A-T-C-C 3′
3′ C-C-T-A-G↑G 5′

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-
G), maka BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh
enzim BamHI berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya
berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al., 1996).

Enzim BamHI bekerja dengan melaksanakan scanning sekuens non-spesifik

di sepanjang DNA dengan meluncur (sliding), sesudah itu saat enzim tersebut
menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa
peneguhan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester
antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).