BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Membicarakan teknik biologi molekuler (kloning gen), tidak lengkap rasanya
jika kita tidak mengulas mengenai vektor kloning. Vektor kloning menjadi penting
karena dia berperan sebagai media agar target DNA bisa diperbanyak untuk
selanjutnya diekspresi menjadi protein yang diinginkan. Analogi sederhananya
adalah ketika kita hendak pergi ke mall yang jaraknya jauh untuk berbelanja, kita
tentu memerlukan alat transportasi untuk mencapainya (bisa angkot, motor, mobil
pribadi). Seperti alat transportasi inilah peran vektor kloning. Meskipun tidak
100% sama karena alat transportasi akan kita tinggalkan jika kita sudah mencapai
mall yang kita tuju, sementara vektor kloning tetap diperlukan, meskipun target
DNA kita sudah masuk ke dalam sel organisme inang yang diinginkan.
Ada sangat banyak vektor kloning yang tersedia saat ini, seperti
plasmid, cosmid, yeast artificial chromosomes (YACs), bacterial artificial
chromosomes (BACs), phage, transposon, dll.
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian dari vector cloning (Plasmid)
2. Untuk mengetahui kegunaan dari vector cloning (plasmid)
3. Untuk mengetahui proses pembuatan plasmid rekombinan.

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam
sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat
terekspresi dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk
membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid
digunakan untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa
diperoleh secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga
disebut sebagai rekayasa genetika.
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai
ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gengen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi
yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada
organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai
pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid
memilki ciri-ciri antara lain :
a. Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)
b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c. Terdapat di luar kromosom
d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil
Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat
diantaranya sebagai berikut :
a. ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya
b. mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk
tidaknya plasmid ke dalam sel inang
c. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah
satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA
asing

d. memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel
inang
Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :
a. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan
pBR 322
b. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah
plasmid Ti
B. Kegunaan plasmid
Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini
plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk
dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan
mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang
diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.
C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika
Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan
kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses
penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai
berikut :
1. Penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada
beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk
prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot
2. Bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat
pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai
tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya
plasmid pada sel inang

3. Apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka

langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong
plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan
pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1
4. Langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang
sesuai pada daerah potongannya
5. Plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu,
yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong
plasmid

D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah
enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi
disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang
digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing
agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang
disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:
1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim
pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs
tersebut
2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan
poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca
dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif

(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Perbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end
dapat dilihat pada tabel 1. berikut ini.

Berbagai contoh restriksi enzim yang mengenali pada situs pemotongan

tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 2.

Proses pemotongan DNA digambarkan pada gambar 3. berikut ini

Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA

E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing
Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung
potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E.
Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:
1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong
2. Penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui
ikatan kovalen antara ujung 3OH dari utas satu dengan ujung 5P dari utas
yang lain
6

3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung
DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu
menjadi satu.

F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan

Plasmid Rekombinan
Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing
tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan
plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara
plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu
yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur untuk
menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut:
1. Menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu
2. Menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor
3. Pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzimrestriksi
semisal dari E. coli
4. Pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim
restriksi yang sama yaitu E. Coli
5. Hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan
menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan
mengikat ujung 3OH dengan ujung 5P dan membentuk ikatan fosfodiester
sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu
6. Terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat
tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk
memperoleh organisme transgenik.

Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil

penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat
pada gambar 6 berikut ini.

Gambar 6. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Vektor cloning merupakan transportasi yang membawa suatu DNA asing
kedalam sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat
terekspresi dalam sel inang. Adapuun Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk
membawa molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid
adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai ganda dan dapat
bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial.
Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang
disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada
organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai
pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan direkayasa.
Pembentukan plasmid rekombinan melalui penyambungan plasmid dengan
DNA asing dan di transfer ke dalam sel inang bertujuan untuk menghasilkan
organisme yang transgenic.
B. Saran
Semoga makalah ini bermanfaat dan menjadi penambah
wawasan kita semua, tentunya dengan rajin-rajin belajar.

DAFTAR PUSTAKA

10