BIOTEKNOLOGI MOLEKULER

Teknik Pemotongan dan

Penempelan DNA

KELOMPOK II:
ANDI MUSDALIFAH
(F1C1 13 008)
KARTI APRIANI GIOVANA (F1C1 13 036)
TRISNAWATI SUDDIN (F1C1 13 040)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2016

Tahapan Teknologi DNA Rekombinan

Enzim Restriksi Endonuklease

Enzim Restriksi Endonuklease
merupakan
enzim yang
memotong bagian internal DNA yang bekerja secara spesifik
(urutan tertentu), disebut sebagai gunting biologi.
Enzim Restriksi Endonuklease memotong DNA tepat pada
ikatan fosfodiester.
Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong DNA pada lokasilokasi spesifik yang mampu mengenali 4 8 urutan nukleotida,
dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat
PALINDROME
Enzim restriksi yang digunakan harus sama antara pemotongan
plasmid dengan pemotong DNA asing.
Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya
terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang
melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, yaitu DNAmetil transferase (dnmt).

Penamaan Enzim Retriksi

Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri
yang menghasilkan enzim tersebut.
Seperti contohnya yang memiliki enzim EcoRI
enzim EcoRI
Kependekan

Kepanjangan

Deskripsi

Escherichia

genus

co

coli

species

RY13

strain

Urutan penemuan

Urutan enzim yang

ditemukan pada bakteri

Enzim Restriksi dengan Sekuens Pengenalnya

Pembagian Enzim
1.

Ujung menggantung 5

. Enzim ini memotong secara asimetris pada situs pemotongan dan

menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5.
. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5 adalah BamHI

Pembagian Enzim
2. Ujung menggantung 3
Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan,
namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3.
Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI.

Pembagian Enzim
3. Ujung tumpul
Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga
menghasilkan ujung tumpul.
Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI.

Hasil Pemotongan
Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif
(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Sticky end : bersifat

lengket mudah untuk
disambung

Blunt end : bersifat

tumpul dan sulit untuk
disambung

Cara Kerja Enzim Restriksi

Enzim restriksi menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan gugus 3 hidroksil (OH) dan
gugus 5 fosfat (PO4-) yang berbentuk asimetris atau sticky ends dan bentuk simetris atau blunt ends

Enzim restriksi dapat melakukan scanning pada untaian molekul DNA. Jika tidak menemukan
restriction sites yang spesifik (mekanisme slidding), maka enzim akan melakukan pergerakan di
sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim restriksi endonuklease akan mengubah konformasinya ketika
mengenali daerah restriction sites yang spesifik dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan
fosfodiester

Enzim retriksi bekerja dengan bantuan kofaktor , contoh Mg 2+, sehingga dalam prosedur percobaannya
sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg 2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses
pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi

Faktor yang Mempengaruhu Kerja Enzim Restriksi

Suhu
Sebagian besar enzim endonuklease restriksi memiliki suhu optimum sekitar 37C.
Beberapa enzim restriksi yang diperoleh dari bakteri thermofilik
memiliki aktivitas
pemotongan optimum pada suhu tinggi

pH
Hampir semua enzim restriksi bekerja dengan baik pada kisaran pH 7.2-8.0

Kekuatan ionik
Hampir semua enzim restriksi dapat menerima kekuatan ionik dari NaCl (50- 150
mM) maupun KCl (10-150 mM), namun beberapa enzim restriksi hanya aktif pada
kekuatan ionik yang diberikan oleh KCl, seperti enzim SmaI

Pengaruh kation
Ion Mg2+ diduga berperan sebagai aktivator molekul air untuk membentuk
nukleofil yang dibutuhkan atau untuk menyebabkan polarisasi ikatan
fosfodiester yang
akan dipotong

Waktu reaksi
Lamanya waktu reaksi enzim ditentukan oleh unit aktivitas enzim. Enzim yang
memiliki unit aktivitas tinggi tidak membutuhkan waktu reaksi yang terlalu lama.

(Pingoud et al., 1993).

Enzim DNA Ligase

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk
menyambung dua ujung potongan DNA
Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3-OH
dari satu untai dan 5-PO4 dari untai DNA lain
Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip
dibanding dengan ujung tumpul.
Enzim DNA ligase bekerja dengan bantuan
kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Jenis kedua enzim
tersebut memerlukan kofaktor yang berbeda, tetapi
memiliki mekanisme katalitik yang sama.
Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA
ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4

Jenis-Jenis DNA Ligase

DNA ligase yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase

T4 DNA ligase
T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen
DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.Untuk
meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi
enzim yang lebih besar.

T7 DNA ligase
Enzim yang dapat mengkatalisis ikatan fosfodiester . Tidak seperti enzim T4,
blunt end ligation tidak efektif dikatalisis oleh T7 DNA ligase. Enzim ini
dihasilkan oleh strain rekombinan bakteri E.coli yang mengandung gen penkode
T7 DNA Ligase.

Penyambungan DNA
Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki
ujung 5-PO4 dengan ujung 3-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa 2 cara,
sesuai hasil pemotongannya
DNA dengan ujung
sticky

DNA dengan ujung

blunt

Cara Kerja Enzim Ligase

1. DNA dengan ujung sticky
Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat menempel dengan
baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung
overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan
phosphodiester sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan
yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung lebih mudah karena kedua
ujung overhang dapat menempel lebih dulu

Cara Kerja Enzim Ligase

2. DNA dengan ujung blunt
Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil
pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih
sulit untuk dilem dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang
yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum
dilem.

Mekanisme Enzim DNA Ligase

Mekanisme DNA ligase dimulai dari
hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP.
Dan menghasilkan kompleks enzimadenylate AMP yang berikatan kovalen
dengan grup -amino residu lysin pada
sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat
inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP
atau
nicotinamide
mononucleotide
(NMN), jika kofaktor berupa NAD+
Kemudian sebagian AMP akan berpindah
dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5fosfat yang berada pada nick utas DNA.
Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan
terbentuk antara ujung 3-OH yang
berada di ujung nick dengan 5-fosfat dan
melepaskan AMP dan enzim adenylate

TERIMA KASIH