High

Performance
Liquid
Chromatography
(HPLC)
PRINSIP KERJA HPLC FUNGSI HPLC

JENIS – JENIS
KOLOM

FAKTOR LAIN YANG

DAPAT
MEMPENGARUHI
HASIL
Keunggulan HPLC
• Otomatis
• Resolusi tinggi
• Cepat dan efisien
• Reproduksibilitas sangat baik
• Preparasi sederhana
Kelemahan HPLC
• Relatif mahal
• Masa kerja pendek (berkaitan dengan
umur kolom)
• Pada laju alir yang tinggi dibutuhkan
biaya yang besar untuk pembelian dan
pembuangan pelarut berkemurnian
tinggi.
 Contoh
kromatogram
HPLC

Pemisahan berdasarkan waktu retensi

Kuantitas berdasarkan luas area

WAKTU RETENSI

Prajogo, 2015
Prajogo, 2015
 Essay on the Effects of Different Light
Example :
Intensities on the Production of
Camptothecin in the Tree of Joy
(Camptotheca accuminata)

In previous experiments, it was shown that a

decrease in light intensity will increase the
production of camptothecin (CPT) (Liu and Adams,
1996)

Di China., digunakan
secara klinis terhadap
senyawa camptothecin
dalam terapi antikanker.

Sumber : Natural Products from Plants, Second Edition

 Metode :
Injeksi Sampel 10 µL → Kolom C-18 dengan Fase gerak asetonitril selama 60
menit → Panjang gelombang untuk mendeteksi CPT adalah 347 nm, suhu 40°C
dan laju aliran 1 mL/menit → Kromatograph
Susanti, 2017
Gas Chromatography
(GC)
Keunggulan GC
• Efisiensi pemisahan yang
tinggi
• Analisis relatif cepat dan
sensitifitasnya tinggi
Kelemahan GC
• Terbatas untuk zat yang
mudah menguap
• Tidak mudah dipakai
untuk memisahkan
campuran dalam jumlah
besar
• Relatif mahal
 Analisa Komponen

• Untuk analisa kualitatif  Komponen-komponen

yang terelusi dikenali dari nilai waktu retensi (TR)
tiap puncak pada kromatogram. TR analit
dibandingkan dengan TR standar pada kondisi
operasi alat yang sama.

• Untuk analisa kuantitatif  Penentuan kadar atau

jumlah analit dilakukan dengan membandingkan
luas puncak analit dengan luas puncak standar.
Contoh hasil kromatogram KG
KELIMPAHAN

WAKTU RETENSI

KROMATOGRAM KOMPONEN MINYAK ATSIRI DAUN KEMANGI (Nurkamalia, 2017)

Metode Analisis Minyak Atsiri Sereh Wangi Secara Kromatografi Gas

Ruwindya., Ind. J. Chem. Anal., Vol. 02, No 02, 2019, pp. 54-59
Chromatotron
(Centrifugal Thin-Layer
Chromatography)
Aplikasi dengan
Kromatotron

Pemisahan Polifenol Penjerap yang digunakan :

Xanton dari tanaman Silika gel dengan ketebalan 2
Gentiana detonsa mm. Ukuran cuplikan :
400mg

Pengelusi CHCl3

Hostettmann dkk., 1980

Aplikasi dengan
Kromatotron

Pemisahan Saponin Menggunakan Penjerap

Ginsenosida dari ekstrak Silika gel (ketebalan 2mm)
Ginseng dengan cuplikan 359 mg

Pengelusi:
CHCl3 : MeOH : H2O
Hostettmann, dkk., 1980
Kelebihan

• Cara Kerja Sederhana

• Tidak perlu mengerok pita
• Pemakaian Pelarut tidak boros
• Plat dapat diregenerasi
• Penotolan cuplikan mudah
• Perolehan senyawa yang dipisah lebih besar dari KLT Preparatif

Kekurangan

• Fase diam yang dapat dipilih terbatas

• Saat pengumpulan sampel memungkinkan tercemari
• Cara pendeteksian terbatas
Countercurrent
chromatography
(CCC)
 PRINSIP KERJA
Countercurrent chromatography (CCC) adalah kromatografi
pemisahan yang merupakan teknik kromatografi cair-cair.
Pemisahan komponen dalam campuran berdasarkan
perbedaan afinitas dari fase gerak dan fase diam

Fase diam dan fase gerak semuanya merupakan cairan.

Partisi dua zat terlarut pada dua fase didasarkan pada
perbedaan factor kapasitas, k dan koefisient distribusi (kd)
pada fase diam dan fase gerak
 KEUNTUNGAN
Banyak keuntungan yang
didapatkan Karena CCC tidak
menggunakan fasa padat
sebagai fasa diam , yaitu :
• Mencegah sampel yang
hilang pada saat proses
adsorpsi pada fasa diam
• Mencegah denaturasi
• Mencegah proses tailing
• Mencegah kontaminas
KERUGIAN
– Butuh waktu lama untuk
menentukan pelarut yang
tepat
– Perubahan komposisi dari
salah satu fase akan
merubah fase yang lain
yang akan merubah gradien
elusi
 SISTEM PELARUT

Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam

memilih sistem pelarut;
• Kelarutan sampel dalam sistem pelarut,
• Stabilitas sampel dalam sistem pelarut, waktu
• Settling/pengendapan dari sistem pelarut,
• Koefisien partisi sampel,
• Retensi yang memuaskan fase diam dalam kolom
 SISTEM PELARUT

Baik air ataupun pelarut organik dari sistem cair dua fasa dapat
digunakan sebagai fasa gerak. kriteria yang harus dimiliki adalah :

1. Pelarut yang digunakan harus membentuk dua fasa yang tidak

bercampur
2. Harus tahan dengan kondisi kolom CCC
3. Sampel harus dapat terpisah pada sistem cair dua fasa yang
dipilih
Skala mengacu pada jumlah produk yg diisolasi : Analitik (< 2 mg), Preparatif ( >2mg up to grams)
TERIMA KASIH