KIM30613

Biokatalis dan
Informasi Genetik
Kuliah 3

Dr. Endang Saepudin

Dr. Endang Saefudin

 Hidrolisis Asam Nukleat
Hidrolisis oleh basa
– RNA mudah terhidrolisis dalam alkali encer,
sedangkan DNA tidak
– Hidrolisis RNA oleh alkali terjadi secara random
sepanjang fosfodiester backbone, menghasilkan
fragmen dengan gugus 2' or 3' fosfat.
Enzymatic hydrolysis
– Enzim yang menghidrolisis asam nukleat disebut
nuklease. Dibutuhkan dalam penggantian asam
nukleat dan juga untuk mencerna asam nukleat
dalam makanan.
Ada dua jenis nuklease: eksonuklease dan
endonuklease
– Eksonuklease bekerja pada ujung
polinukleotida (ujung 3' atau 5', tergantung pada
spesifisitasnya) dan secara berurutan
menghidrolisis ikatan fosfodiesternya.
– Endonuklease memutus ikatan fosfodiester di
bagian dalam polinukleotida. Endonuklease
umumnya tidak memutus ikatan fosfodiester
secara berurutan
Nuklease dapat memutus ikatan fosfodiester dengan
hasil yang berbeda
– Nuclease tipe "A" memutus pada sisi 3'. Hasilnya
berupa gugus fosfat yang masih terikat pada sisi 5'
dari leaving polynucleotide
– Nuklease tipe "B" memutus pada sisi 5' ikatan
fosfodiester, menghasilkan gugus fosfat yang
tertinggal pada ujung 3' dari polinukleotida
 Restriction endonuclease
• Bakteri dan mikroorganisme lainnya memiliki
endonuklease yang dapat menghidrolisis duplex DNA
pada daerah yang spesifik.
• Penemuan enzim-enzim ini telah menyebabkan
suatu “major breakthrough” dalam perkembangan
rekayasa genetika. Untuk pertama kalinya,
ditemukan cara untuk “memotong" DNA pada lokasi
yang spesifik, dan penggabungkan fragmen DNA.
• Enzim-enzim ini dikenal dengan restriction
endonuclease, yang sebenarnya adalah bagian dari
sistem immun mikroorganisme untuk
mempertahankan diri dari invasi DNA asing.
• Restriction endonuclease Type I, II dan III
• Type I:
– Membutuhkan ATP untuk hidrolisis
– Mampu memetilasi DNA pada lokasi spesifik
– Memotong secara random
• Type III:
– Membutuhkan ATP untuk hidrolisis
– Juga mampu memetilasi DNA pada lokasi spesifik
– Memotong pada rangkaian nukleotida yang
spesifik
Type II:
– Tidak membutuhkan ATP (menggunakan energi
pada ikatan fosfodiester untuk hidrolisis)
– Tidak memetilasi DNA
– Memotong pada posisi spesifik
– "Workhorse" of genetic engineering efforts
– Umumnya memotong pada rangkaian
palindrome pada DNA duplex.
– Palindrome merupakan suatu kata atau kalimat
yang bila dibaca bolak balik berbunyi sama.
Contoh : anna, Madam I'm Adam
• rangkaian GGTACC merupakan palindrom dari
rangkaian CCATGG
• Dapat memutus DNA duplex menghasilkan ujung
baik "blunt", ataupun "sticky".
– Ujung sticky dapat berupa "3' overhang" atau "5'
overhang"
– Ujung sticky dari fragment DNA yang berbeda
yang dihasilkan oleh enzim yang sama
merupakan complementary (dan dapat digabung
menghasilkan DNA baru)
EcoR1 Restriction Endonuclease
• Diisolasi dari bakteri E. coli
• Memotong pada rangkaian palindrom "GAATTC"

 Memotong di antara G|A menghasilkan 3'-OH pada

basa G dan 5'-P pada A (nuklease type A).
Menghasilkan ujung sticky yang merupakan 5'
overhang:
 Fragment yang dihasilkan dari hidrolisis EcoR1
dapat digabungkan membentuk DNA baru:
 Struktur Primer asam nukleat, Struktur sekunder
DNA, Denaturasi/renaturasi DNA
• Asam nukleat adalah " molekul yang mengandung
informasi " yang merupakan informasi keturunan.
• Penentuan susunan rangkaian polinukleotida
(struktur primer) sangat penting untuk memahami
informasi yang dikandungnya.
• Penentuan susunan rangkaian (sequencing)
polinukleotida lebih sulit daripada sequencing
protein. Ini karena polinukleotida 3 kali lebih
panjang dari protein (setiap asam amino dikode oleh
tiga nukleotida dalam suatu polinukleotida).
Mengapa 3 nukletida mengkode 1 jenis as. Amino?
– Hanya ada empat basa pada DNA, A, G, C, T.
sedangkan asam amino ada 20 macam
– Jika pada sintesis protein, 1 basa mengkode 1
asam amino, maka polinukleotida hanya akan
mengandung informasi untuk 4 macam asam
amino.
– Jika masing-masing asam amino dikode oleh 2
nukleotida, maka polinukleotida hanya dapat
mengandung informasi untuk 16 macam asam
amino acids (42).
• Jika 3 buah nukleotida digunakan untuk mengkode
setiap asam amino, maka total akan ada 64
kombinasi (43) – lebih dari cukup informasi untuk
secara specifik mengkode 20 asam amino
(sebenarnya, dibutuhkan signal untuk "stop", jadi
paling sedikit dibutuhkan 21 jenis informasi yang
berbeda)
Metoda sequencing DNA yang sering digunakan
umumnya mengacu pada salah satu metoda di
bawah ini:
– Sanger sequencing
– Di-deoxy sequencing
– Chain termination sequencing
Ketiganya merupakan metoda yang sama yang
ditemukan oleh Fred Sanger, :
– Menggunakan enzim DNA polymerase, untuk
memperbanyak DNA
– Penggunaan basa di-deoksi (ddNTP) selain
dNTP dalam rangkaian DNA yang baru
terbentuk. Masuknya di-deoksi menyebabkan
terminasi pada perpanjangan rantai.
Replikasi menggunakan template, primer,
polymerase and dNTP's
Efek dari penambahan ddNTP selama polimerisasi
DNA
Penambahan satu set ddNTP , akan menghasilkan terminasi
seperti di bawah ini:
• Fragmen-fragmen yang terbentuk dianalisa dengan
gel elektroforesis
• Hasil sequencing gel akan “terbaca" sebagai DNA
fragment dengan arah the 5'→ 3'
5' A T C G T A G C C A G T 3'
• Karena DNA yang baru terbentuk merupakan
komplementer dari DNA template, maka sequence DNA
template haruslah:
5' A T C G T A G C C A G T 3'
3' T A G C A T C G G T C A 5'
• Atau menggunakan convensi orientasi standar 5'→ 3' :
5' A C T G G C T A C G A T 3‘

Dengan penggunaan otomatisasi pada metoda ini,

>1000 basa dapat ditentukan dengan sekali baca
 Struktur Sekunder DNA
DNA double stranded dapat membentuk salah satu dari tiga tipe
of struktur sekunder, tipe A, B or Z.
B DNA
– Konformasi DNA terbanyak dalam larutan
– Duplex (dua rantai) antiparallel helix
– 10 pasang basa per turn helix
• Setiap ps. basa menambah panjang helix sebesar 3.4Å
• Setiap turn helix panjangnya 34Å, (disebut pitch).
– Basa-basanya saling berpasangan melalui interaksi ikatan
hidrogen.
– Cincin aromatik dari basa-basanya tersusun sedemikian rupa
(stack on top of each other up the helix). Hal ini menyebabkan
terjadinya interaksi hidrophobik (van der Waals).
– Gula-fosfat “backbones” dari kedua rantai tidak benar-benar
180° berseberangan. Menyebabkan terjadinya minor dan major
groove pada duplex.
A DNA
• 11 pasang basa per turn
• Satu pitch panjangnya 24.6 angstroms
• Helixnya lebih pendek dan lebih gemuk daripada
bentuk B
• Dehydrated DNA may adopt A form
• Kemungkinan tidak terjadi pada DNA in vivo, tapi
paling mungkin terbentuk dari duplex antara DNA
dan RNA
Z DNA
• Merupakan suatu left-handed duplex helix
• Bentuk B dand Z dapat saling bertukar.
• Pertama kali ditemukan pada CGCGCG repeating
DNA
• Metilasi basa C menyebabkan perubahan konformasi
B→ Z. Metilasi DNA merupakan mekanisme regulasi
yang penting pada ekspresi gen. Thus, Z DNA
mungkin secara fisiologi berhubungan dengan
regulasi pada ekspresi DNA.
Distortion of helical structure by intercalating agents
– Some organic compound with aromatic rings can
insert into the DNA double helix, and shift the
base stacking register, or cause a base to "flip
out" of the duplex
– Such intercalating agents can cause errors
during the replication of DNA, and are therefore,
carcinogenic.
– One such agent found in molecular biology
laboratories is ethidium bromide