Cara Kerja

1. Isolasi Protein

Menimbang sample seberat 0,5 gram dan meletakkan sampel dalam mortar dingin

Menambah larutan PBS secukupnya

Menghaluskan sampel dengan menggunakan pistil

Menambahkan PBS-Tween PMSF sebanyak 2000µl

Mengambil dengan pipet dan memasukkan ke dalam 2 tabung eppendorf dengan

masing – masing sebanyak 1,5ml

Mensonifikasi dengan menggunakan sonikator selama 10 menit

Mensentrifuge dengan kecepatan 6000rpm selama 15 menit dengan suhu 4⁰C

Mengambil supernatan dan meletakkan pada 4 eppendorf baru, masing – masing

sebanyak 500µl

Menambahkan masing – masing 500µl Ethanol PA dan mengocok sampai

homogen

Mendiamkan didalam frezeer selama 24 jam

Mensentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm dengan suhu 4⁰C selama 15 menit
 Membuang Ethanolnya dan membiarkan terbuka pada suhu ruang (kulkas)

Memasukkan kedalam kulkas dengan suhu 4⁰C selama 24 jam

Dikeluarkan dari kulkas dan menambahkan Tris – HCl pH 6,8 sebanyak 100 µl

Mengocok hingga homogen dan disimpan didalam freezer

Mengambil supernatan dan dimasukkan dalam tabung eppendorf baru

2. Proses SDS PAGE

Mengambil supernatan dalam tabung dan memasukkan kedalam mikrotube

sejumlah 10µL sampel isolat protein

Menambahkan 10µL Tris – HCl dan larutan RSB sebanyak 20µL

Memanaskan dengan suhu 90⁰C selama 5 menit

Melakukan elektroforesis pada tegangan 200 volt hingga protein turun hingga gel
kebawah

Melakukan staining protein dengan coomasive brilliant blue 0,1%

1. Prosedur Elektroforesis SDS-PAGE
a. Pembuatan Separating Gel 12,5 %

Mencampurkan bahan separating gel kedalam tabung falcon dengan

menggunakan mikropipet Bahannya sebagai berikut :

Akrilamide-Bis 30% 2793 µL

Tris –cl 1,5 M pH 8,8 2250 µL

dH2O 2046 µL

SDS 10% 112,5 µL

APS 10% 112,5 µL

TEMED 5 µL

Memasukkan larutan separating gel kedalam rangkaian plate elektroforesis yang

akan digunakan

Memberikan aquades diatas gel separating agar dapat membentuk permukaan yang
lurus

Menunggu gel hingga mengeras dan mengeluarkan aquades dengan menggunakan

tissue

b. Pembuatan Stacking Gel 3%

Mencampurkan bahan separating gel kedalam tabung falcon dengan

menggunakan mikropipet Bahannya sebagai berikut :

Akrilamide-Bis 30% 552 µL

Tris –cl 0,5 M pH 6,8 675 µL

dH2O 300 µL

SDS 10% 45 µL

APS 10% 45 µL

TEMED 5 µL
 Memasukkan larutan separating gel kedalam rangkaian plate elektroforesis yang
akan digunakan

Memasangkan sisir elektroforesis untuk membentuk sumuran – sumuran sebagai

tempat memasukkan isolat protein

Menunggu gel hingga mengeras dan melepaskan sisir elektroforesis dari gel

Meletakkan gel yang telah mengeras kedalam chamber elektroforesis

2. Prosedur Running Elektroforesis

Menuangkan larutan buffer kedalam chamber elektroforesis

Memasukkan sampel isolat protein 10 µL dan larutan RSB kedalam tabung

eppendorf dengan perbandingan 1:1 kemudian mendidihkan selama 5 menit
dengan suhu 100⁰C

Memasukkan isolat yang telah tercampur larutan RSB dari tabung eppendorf
kedalam sumuran gel dan memasukkan marker protein kedalam salah satu
sumuran yang tidak diisi oleh isolat protein sebanyak 10 µL

Mensetting alat elektroforesis dengan voltase 130v, kuat arus 60mA, dan waktu 90
menit, kemudian mengelektroforesis hingga tracking dye 0,5 cm diatas dasar

Meletakkan gel hasil elektroforesis kedalam wadah plastik kemudian memasukkan

larutan staining hingga gel terendam

Menshaker gel dengan menggunakan shaking rotary selama 30 menit kemudian

membuang larutan staining gel
 Merendam gel didalam larutan destaining selama 1 malam atau 24 jam

Menshaker gel hingga warna gel bening kemudian membuang larutan destaining

Menscan gel dengan menggunakan scanner

Menentukan berat molekul protein dengan menggunakan gel yang telah discan
menggunakan bantuan marker dengan menghitung rumus Rf (Retardation factor)
masing – masing pirta dengan menggunakan rumus

Rf = Jarak yang ditempuh oleh senyawa

Jarak yang ditempuh oleh permukaan pelarut

Tabel 1.1 hasil perhitungan Konsentrasi Protein

Sample Protein
No ID User Name Date and time conc Unit A280 260/280 Sample Type
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
1 Insang 1 2000 14:19 16.891 mg/ml 16.891 1.50 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
2 Insang 2 2000 2:19 22.690 mg/ml 22.690 1.51 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
3 Insang 3 2000 2:20 13.285 mg/ml 13.285 1.48 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
4 Insang 4 2000 2:21 13.456 mg/ml 13.456 1.63 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
5 Usus 1 2000 2:24 1.650 mg/ml 1.650 1.60 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
6 Usus 2 2000 2:25 1.382 mg/ml 1.382 1.47 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
7 Usus 3 2000 2:26 2.650 mg/ml 2.650 1.49 ml
NanoDrop 01/11/2016 1 Abs = 1 mg /
8 Usus 4 2000 2:27 2.159 mg/ml 2.159 1.52 ml
Tabel 1.2 hasil perhitungan Berat Molekul Protein

No a b Rf (x) BM(ANTI LOG BM) LOG BM (Y)

1 0,4 7,2 0,055555556 138,3212449 2,140888889
2 0,7 7,2 0,097222222 116,3604938 2,065805556
3 1 7,2 0,138888889 97,88636971 1,990722222
4 1,1 7,2 0,152777778 92,4047815 1,965694444
5 1,4 7,2 0,194444444 77,73401702 1,890611111
6 1,8 7,2 0,25 61,73052919 1,7905
7 1,9 7,2 0,263888889 58,27365014 1,765472222
8 2,1 7,2 0,291666667 51,929802 1,715416667
9 2,4 7,2 0,333333333 43,68509991 1,640333333
10 2,8 7,2 0,388888889 34,69143161 1,540222222
11 2,9 7,2 0,402777778 32,74872863 1,515194444
12 3,3 7,2 0,458333333 26,00658535 1,415083333
13 3,9 7,2 0,541666667 18,40418824 1,264916667
14 4,3 7,2 0,597222222 14,61522668 1,164805556
15 4,5 7,2 0,625 13,02416831 1,11475
16 5,2 7,2 0,722222222 8,700727269 0,939555556
 BAB III

Alat dan Bahan

Alat
a. Gunting
b. Neraca Analitik
c. Mortar dan pistil
d. Lap
e. Tabung eppendorf
f. Tabung Falcon
g. Rangkaian plate elektroforesis
h. Sisir elektroforesis
i. Chamber elektroforesis
j. Mikropipet 10µl, 100 µl, 1000 µl
k. Vortex otomatis
l. Vortex Manual
m. Shaking rotary
n. Sentrifuge dingin
o. Freezer
p. Kulkas
q. Scanner
r. Wadah

Bahan
a. Sampel (insang Cyprinus carpio)
b. Larutan PBS (Phosphat Buffer Saline)
c. Larutan PBS – Tween PMSF
d. Larutan Ethanol PA (Pure Analis)
e. Larutan Tris- HCl pH 6,8
f. Larutan RSB (Reducing Sample Buffer)
g. Larutan Akrilamide-Bis 30 %
h. Larutan Tris-cl 1,5 M pH 8,8
i. Larutan Tris-cl 0,5 M pH 6,8
j. Larutan dH2O
k. Larutan SDS 10%
l. LarutanAPS 10%
m. LarutanTEMED
n. Larutan Running Buffer
o. Marker protein
p. Aquades
q. Sarung tangan karet
r. Masker
s. Tissue
t. Kertas hisap
u. Plastic wrap
v. Allumunium foil