Kanker paru-paru adalah penyebab utama kematian karena keganasan di seluruh dunia

[1]. Paru-paru sel kecil-bebas kanker (NSCLC lanjut) account untuk sekitar 80% dari
kasus kanker paru-paru didiagnosis. Jenis utama dari NSCLC lanjut, diklasifikasikan oleh
histologi, adalah karsinoma sel skuamosa, besar sel karsinoma, dan adenokarsinoma.
Adenokarsinoma adalah jenis yang paling umum kanker paru-paru yang terlihat di non-
perokok dan wanita, dan insidens relatif adenokarsinoma telah meningkat secara
dramatis dalam beberapa dekade terakhir [2]. Pengobatan pilihan untuk NSCLC lanjut
tahap awal adalah reseksi bedah yang dilengkapi oleh ajuvan berbasis cisplatin
kemoterapi, yang meningkatkan ketahanan hidup 5 tahun pasien, tetapi dengan hanya 4
5% [3]. Meskipun operasi pengobatan mungkin terbaik, hanya 20-25% dari pasien NSCLC
lanjut cocok untuk berpotensi kuratif reseksi [4]. Pasien dengan kanker paru-paru yang
canggih, yang tidak baik untuk reseksi calon, umumnya memiliki prognosis yang buruk
atau akhirnya mengembangkan tahan penyakit bahkan ketika diperlakukan dengan baru
agen kemoterapi atau terapi ditargetkan molekuler [5 7]. Dengan tingkat kelangsungan
hidup 5 tahun secara keseluruhan kurang dari 15% [8], pasien yang jelas membutuhkan
baru, efektif pilihan terapi.

Virus-seperti partikel (VLPs) yang terbuat dari protein struktural virus, tetapi non-
mematikan karena mereka tidak mengandung genom virus. Kemampuan VLPs untuk
paket eksogen DNA membuat mereka vektor yang menjanjikan untuk terapi gen [9]. JC
virus (JCPyV) adalah polyomavirus manusia yang menyebabkan infeksi asimtomatik
dalam kebanyakan orang dewasa penduduk dan progresif multifokal leukoencephalopathy
pada pasien AIDS [10]. JCPyV memasuki inang manusia melalui jaringan stroma tonsil
saluran pernapasan [11] dan bertahan di ginjal dan jaringan limfoid selama latensi [12,
13]. Terminal (2-6)-sebuah komponen penting dari reseptor JCPyV [14], terkait sialic
acid berlimpah dinyatakan dalam paru-paru manusia [15]. Temuan ini menunjukkan
bahwa paru-paru mungkin rentan terhadap infeksi JCPyV. Laporan terbaru dari adanya
JCPyV DNA dan protein dalam paru-paru manusia karsinoma [16, 17] menunjukkan
bahwa JCPyV dapat menginfeksi sel karsinoma paru-paru manusia. Protein kapsid utama
JCPyV, VP1, telah dinyatakan dalam E. coli [18], ragi [19], dan sel-sel serangga [20] dan
mampu merakit diri ke VLPs (JCPyV VLPs) di masing-masing sistem. Selain itu, JCPyV
VLPs mampu Kemasan eksogen DNA selama proses perakitan, menjaga DNA yang
terlindung dengan baik, dan memberikan DNA ini dengan efisiensi tinggi ke dalam sel
rentan JCPyV untuk ekspresi [21 23]. Dengan demikian, JCPyV VLPs dapat digunakan
untuk memberikan gen ke dalam sel karsinoma paru-paru manusia untuk tujuan
terapeutik. Terapi gen untuk kanker adalah penggunaan vektor pengiriman gen yang
dapat menavigasi ke sel-sel tumor dan memungkinkan terapi gen untuk secara khusus
dinyatakan dalam sel-sel tumor [24]. Sebagai terapi gen yang potensial untuk kanker,
menggabungkan JCPyV VLPs dengan kanker tertentu promotor dapat sangat
meningkatkan kekhususan jaringan mereka. Surfaktan protein B (SP-B) adalah protein
hormon diatur paru-paru yang memainkan peran penting dalam fungsi surfaktan dan
homeostasis [25]. Karena ekspresi SP-B dibatasi untuk alveolar tipe II sel dan sel-sel
Clara paru-paru, promotor SP-B dapat digunakan untuk terapi gen dari paru-paru
karsinoma [26]. Dalam studi ini, kami menguji jaringan selektivitas promotor SP-B dengan
menggunakan mengemudi ekspresi gen wartawan atau bunuh diri gen dalam sel
karsinoma paru-paru. Kemampuan JCPyV VLPs membawa gen bunuh diri didorong oleh
promotor SP-B manusia untuk tumor adenocarcinoma paru target dalam hewan model
juga dinilai

Bahan dan metode

sel baris A549 manusia paru sel-sel adenokarsinoma (ATCC, CCL-185) tetap
dipertahankan dalam Dulbecco's dimodifikasi Eagle's media (DMEM) (Gibco, Cat. No.
1230-032) dilengkapi dengan 10% janin sapi serum (FBS) dan antibiotik (100 penisilin
U/ml dan 100 Streptomisin g/ml). CH27 paru-paru manusia skuamosa karsinoma sel
(hadiah dari J. T. Chang [27]) yang ditanam di monolayer budaya di DMEM yang
mengandung 10% FBS, antibiotik, 2 mMglutamine, 1.5 g/L natrium bikarbonat, dan asam
amino non-esensial 0,1 mM. H460 paru-paru manusia besar sel karsinoma sel (ATCC,
HTB-177) dipelihara dalam RPMI 1640 menengah dengan 2 mM L-glutamine dan
disesuaikan untuk mengandung 10 mM HEPES, 1 mM piruvat natrium, glukosa 4.5 g/L,
1.5 g/L natrium bikarbonat, dan 10% FBS. IMR32 sel-sel manusia neuroblastoma (ATCC,
CCL-127) yang dibudidayakan di media penting minimal 90% Eagle dengan Earle's
seimbang larutan garam, 2 mM Lglutamine, 1.5 g/L natrium bikarbonat, asam amino non-
esensial 0,1 mM, dan 1.0 mM natrium piruvat dan 10% panas-inactivated FBS. HK-2 sel
(ATCC, CRL-2190), garis sel proksimal tubulus ginjal manusia diabadikan oleh virus
papiloma manusia tipe 16 E6 E7 gen, tetap dipertahankan dalam 1:1 DMEM:Ham F12
(Gibco, Cat. No. 11765-054) dilengkapi dengan 5 transferrin g/mL (Merck, kucing. No.
616424), 5 g/mL insulin (Sigma Aldrich, St Louis, MO, Cat. Tidak. I-1882), 400
hidrokortison ng/mL (Sigma-Aldrich, kucing. Tidak. H-0315), 5 selenite natrium ng/mL
(Sigma-Aldrich, kucing. Tidak. S-9133), 10% FBS, dan antibiotik.

Pembangunan ekspresi plasmid yang mengandung SP-B promotor

fragmen promotor SP-B manusia ini diperkuat dari sel-sel DNA A549 genom oleh PCR
menggunakan primers 5'-GGGCCCACATGTATAGGGCTGTCTG-3 'dan 5'-CCGTCGACG
CATGGCCCCTTATAGC-3'. PCR produk dicerna dengan PciI dan SalI (NEB, Ipswich, MA)
dan ligated menggunakan T4 DNA ligase (NEH) dengan pEGFP-N1 plasmid DNA
(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) yang promotor CMV telah dihapus oleh
pencernaan dengan PciI dan SalI. Plasmid yang dihasilkan, pSPB-gfp, dikonfirmasi oleh
DNA sequencing. SP-B promotor PCR produk yang dijelaskan di atas juga dicerna
dengan SpeI dan SalI (NEH) dan ligated menggunakan T4 DNA ligase dengan pUMVC1-
tk plasmid DNA (Aldevron, Fargo, ND) yang promotor CMV telah dihapus oleh
pencernaan dengan SpeI dan SalI. Plasmid yang dihasilkan, pSPB-tk, dikonfirmasi oleh
DNA sequencing

Produksi JCPyV VLPs dikemas dengan ekspresi plasmid

The JCPyV VP1 ekspresi plasmid pFlag-JCPyVP1 [18] bersama berubah dengan salah
satu pEGFP-N1, pUMVC1-tk dan pSPB-tk menjadi JM109 E. coli (Promega, Madison,
WI). Plasmid pFlag dibeli dari Promega (Madison, WI). VLPs dikemas dengan pEGFP-N1,
pUMVC1-tk dan pSPB-tk dirujuk sebagai gfp-VLPs, CMVtk-VLPs dan SPBtk-VLPs.
Prosedur untuk mempersiapkan dan memurnikan gfp-VLPs dan tk-VLPs digambarkan
oleh Chen et al. [22]. Secara singkat, strain berubah E. coli ditumbuhkan dalam media LB
dengan ampicillin dan kanamycin untuk memilih untuk pFlag-JCPyVP1 dan pEGFP-N1,
pUMVC1-tk atau pSPB-tk masing-masing. Ekspresi protein VP1 disebabkan oleh
penambahan 0.5 mM (kadar akhir) isopropil -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) untuk 8 h
pada 30 C. Untuk pemurnian VLP, supernatant E. coli lysate diambil dan dikenakan 20%
sukrosa bantal sentrifugasi dan CsCl kecepatan gradien sentrifugasi. Pecahan dengan
aktivitas penggumpalan tersebut dikumpulkan dan dialyzed terhadap Tris-buffered saline
(TBS) (10 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl). VLPs yang terkonsentrasi menggunakan
filter Centricon (Millipore, Billerica, MA, USA).