TUGAS KELOMPOK

LAPORAN BIOMOL

Dosen pengampu :
Meutia Srikandi Fitria, S. Si, M. Biotech

Nama Anggota :
1. Nurbania Rehalat (G1C021130)
2. Ardya Dena P (G1C021142)
3. Berlian Syifa A (G1C021143)
4. Sabran Jamil (G1C021165)

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

D4 TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG
2022/2023
 ELEKTROFORESIS PROTEIN SDS-PAGE
(SAMPEL BAKSO)

A. Dasar Teori
Pemisahan protein dengan SDS-Page digunakan untuk menganalisis protein secara
kualittatif dan ukurannya disamakan dengan ukuran pada marker protein yang digunakan. Pola
pita protein organisme ketika dielektroforesis dapat digunakan untuk menjelaskan proses
ekspresi gen berupa protein yang terdapat pada makhluk hidup. Pada analisa kuantitatif dengan
spektrofotometri, pertama-tama dibuat kurva standar BSA yg dengan perhitungan regresi dapat
digunakan untuk mengetahui konsentrasi proteinnya. BSA adalah Bovine Serum Albumin yang
merupakan albumin murni dari sapi.
Pemisahan dengan SDS-Page berdarakan pada ukuran protein yang digunakan.
Pengaturan ini dilakukan dengan memorifikasi konsentrasi akrilamide pada keseluruhan larutan
untuk membuat gel. Pada metode ini digunakan 2 jenis gel yakni stacking gel dan separating
gel. Keduanya memiliki fungsi yang berbeda, stacking gel berfungsi untuk menstabilkan
protein yg akan dipsahkan, sedangkan separating gel berfungsi memisahkan protein sesuai
berat molekulnya. Pada pembuatan gel, pertama yg harus dilakukan adalah mencampur semua
bahan pembuat gel kecuali TEMED dan APS. APS dan TEMED diberikan tepat setelah gel
akan digunakan. Hal ini karena akan terjadi reaksi polimerisasi spontan antara akrilamide yg
akan membentuk crossline dengan agen bifungsional seperti N,N’-methylene-bis-akrilamide.
Proses polimerisasi ini melibatkan bantuan katalis berupa APS dan TEMED. SDS merupakan
deterjen anionic yang dapat bekerja dalam kisaran pH yang luas. Suatu rantai polipeptida akan
berikatan dengan sejumlah tertentu SDS sesuai ukuran molekul (berat molekul). Interaksi
polipeptida dengan SDS akan membuatnya memiliki permukaan yang bermuatan negative.
Selain itu, SDS dapat mendenaturasi protein tersebut, yakni akan bergerak kearah kutub positif
dalam running buffer.
Sampel yang sudah dilakukan elektroforesis protein kemudian dilakukan proses Staining
menggunakan comassie blue Hasil SDS PAGE yang di staining dengan commasie blue tidak
bias memberikan pewarnaan terhadap bend protein, hanya marker terwarnai. Comassie blue
akan mengikat gugus amin pada protein sehingga pewarna ini hanya dapat memberikan
pewarnaan pada protein. Semakin sedikit konsentrasi protein, maka akan semakin sedikit warna
yang diikat sehingga warna tampak pudar. Setelah proses pewarnaan, untuk menghilangkan
warna pada gel yang tidak terikat oleh protein, dilakukan pencucian gel yaitu destaining. Jika
gel sudah transparan dan hanya pita protein yang mengikat warna, maica pencucian dihentikan.
Proses selanjutnta yaitu dilakukan press terhadap gel menggunakan plastik.

B. Tujuan
Mendapatkan profil protein suatu sampel untuk analisis lanjut secara deskriotif dan kualitatif
terhadap pemberian perlakuan pada sampel.

C. Prinsip
 1. Migrasi sampel protein melewati pori-pori gel polyacrilamid dengan bantuan eneergi
listrik
2. Molekul protein kecil/bermuatan tinggi (lebih cepat)
3. Molekul protein besar/bermuatan rendah (lebih lambat)

D. Alat dan Bahan

a. Alat
- Paket alat SDS-PAGE
- Mikropipet
- Tip
- Mikrotube save lock
- Pipet tetes
- Vortex
- Beaker glass
- Panci
- Mangkuk
- Es batu
- Erlenmeyer 5 ml
- Neraca analitik
- Plastik
- Sendok
- Botol kaca
- Tepak makan
- Stirrer
- Kompor
- Tissu

b. Bahan
- Larutan PBS 1x ph 7,4
- Aquadest steril (dH2O)
- Sampel buffer
- Sampel protein (bakso)
- Elektroda buffer
- Stacking gel
- Separating gel
- Larutan stanning
- Larutan destanning
- Asam asetat 10%

E. Cara Kerja
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan, semua harus dalam keadaan steril
b. Preparasi sampel :
PBS 1x + sampel protein + sampel buffer (4µl) = 20 µl
 Sampel buffer 4µl diperoleh dari :
5x sampel buffer (1x sampel buffer)
N1.V1 = N2.V2
5.V1 = 1.20
V1 = 20/5
V1 = 4µl.2
V1 = 8 µl

Konsentasi protein :
Y = 0,0212x + 0,138
Y = 0,697
0,697 = 0,0212x + 0,138
0,0212x = 0,697 – 0,138
0,0212x = 0,559
0,559
x
0,0212
26,367
x
2
X= 13, 18 mg/µl
Volume sampel
20 mg /µl
x 1 ml
13 ,18 mg/ µl
=1,517 ml x 2
= 3,034 µl ( Dibulatkan 3 µl)

PBS
= 20 – 4 – 1,517
= 14,483 x 2
= 28,966 µl
= 29 µl

 Pembuatan sampel :
1. Dipipet sebanyak perhitungan dan dimasukkan dalam mikrotube save lock sesuai label.
2. Dipipet sampel buffer sebanyak 4µl ke dalam masing-masing mikrotube save lock yang
telah disiapkan
3. Ditambahkan PBS 1x ph 7,4 sesuai perhitungan dan dimasukkan ke dalam mikrotube
save lock.
4. Diletakkan pada pelampung yang telah disediakan dan panaskan ke dalam air mendidih
selama 2 menit untuk memecah rantai protein pada sampel
5. Diangkat dan diletakkan pada mangkuk yang berisi air dan es batu.
c. Pembuatan 1,5M Tris/HCl (pH 8,8), tidak butuh pengaturan pH

Tris base 36,8 g

1N HCl 45 ml
H2O Sampai volume 200 ml

d. Pembuatan 1M Tris/HCl (pH 6,8)

Tris base 24,2 g

H2O 150 ml
Atur pH sampai 6, 8 menggunakan HCl kemudian buat total volume hingga 200 ml
e. Pembuatan 5x Loading Buffer (Biotek UGM)

1M Tris/HCl (pH 6,8) 2.5 ml

SDS 2.0 g
DTT/β-Mercapthoetanol 0.5 g/5 ml
Bromphenol Blue (BPB) 1.0 mg
Glyserin 10 ml

f. Pembuatan 5x Tris/Glysin Elektroda Buffer/Running Buffer (final 25mM Tris, 250

mM glysin, 0,1% SDS)

Tris base 15,1 g

Glysin 34 g
SDS 10% 50 ml
H2O Sampai 1000 ml

g. Pembuatan Larutan Acrylamide 30%

Acrylamide 29 g
N,N-methylenebisacrylamide 1g
Dilarutkan dalam 100 ml dH2O dan saring
h. Pembuatan PBS 5x pH 7,4

NaCl 42,4 g
K2HPO4 6,66 g
KH2PO4 1,72 g
Dilarutkan dalam 1 L dH2O

i. Pembuatan Larutan staining Comassie Brilliant Blue (CBB)

Comassie Blue 0.25% atau 0.1% 0.25 g 0.1 g

Methanol 50 ml 40 ml
Asam asetat glacial 10 ml 10 ml
Aquadest 40 ml 50 ml
Total volume 100 ml 100 ml

j. Pembuatan Larutan destaining

Methanol (50%/40%) 500 ml 400 ml
Asam asetat glacial (10%) 100ml 100 ml
Aquadest 400 ml 500 ml

k. Pembuatan SDS 10%

10 SDS dalam 100 ml dH2O
l. Pembuatan APS 10%
0, 1 g APS dalam 1 ml dH2O

 Preparasi gel
1. Setting mini slab gel
2. Siapkan gradient gel/separating gel
3. Siapkan 5% stacking gel
Pada waktu gradient gel sudah mengalami polimersi, buang iso-propanol dan cuci
permukaan gel dengan aquadest.
  Pembuatan Gradient gel/Separating gel
Gradient gel (15ml ) dapat digunakan untuk dua muka
Nama Reagent 12% 10% 8%
Acrylamide 60 ml 5,0 ml 4 ml
1,5M Tris (pH 3,8 ml 3,8 ml 3,8 ml
8,8)
10% SDS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml
dH2O 4,9 ml 5,9 ml 6,9 ml
TEMED 0,006 ml(12-15µl) 0,006 ml 0,006 ml
APS 10 % 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml
Untuk meratakan permukaan gradien gel tambahkan aquadest atau iso-propanol (butanol)
sebanyak 0,2-0,5 ml pada permukaannya.
 Pembuatan Stacking gel
Nama reagen volume
dH2O 2,7 ml
Acrilamide 30 % 0,67 ml
1,5 M Tris (ph 0,5 ml
6,8)
SDS 10 % 0,04 ml
APS 10 % 0,04 ml
TEMED 0,004 ml (8-10 µl)

 Proses SDS-PAGE
1. Siapkan semua alat yg diperlukan untuk SDS PAGE
2. Glassplate sebelum digunakan sebagai tempat cetakan terlebih dahulu diuji dengan
aquadest untuk melihat kebocoran pada alat
3. Masukkan separating gel terlebih dahulu ke dalam glassplate yg sudah diuji sampai tanda
batas, tunggu hingga menjendal
4. Selanjutnya masukkan stacking gel sampai tanda batas, hindari gelembung udara.
5. Masukkan sisir/comb secara pelan-pelan hindari gelembung udara. Tunggu sampai terjadi
polimerisasi
6. Setelah menjendal, ambil sisir/comb secara tegak lurus keatas dan lepas karet pembatas
7. Siapkan alat untuk SDS PAGE. Kemudian glassplate dijepit pada alat
8. Masukkan running buffer ke dalam chamber sampai tanda batas.
9. Lakukan pemanasan selama 10 menit dengan tegangan 100 V pada power supply dan
tutup chamber
10. Masukkan sampel ke dalam sumuran, masing-masing sumuran diisi dengan 20µl sampel,
dan masukkan marker pada sumuran sebanyak ketentuan prosedur manual marker
11. Tutup chamber, tunggu sampai protein turun ke bawah dan tidak boleh melewati batas
12. Setelah protein turun, matikan alat, angkat glassplate dan angkat gel lalu masukkan ke
dalam tempat stanning
13. Lakukan stanning dengan CBB untuk memberi warna, dengan menambahkan stanning
pada gel dan dgoyang pada shaker selama ± 1 jam
14. Hilangkan pewarna dengan menambah larutan destanning secara perlahan sampai gel
berubah warna menjadi bening dan hanya protein yang terwarnai
15. Tambahkan asam asetat 10 % pada gel untuk memperhalus warna pada protein.

 Press pada gel :

1. Siapkan alat dan bahan untuk press gel
2. Letakkan mangkuk terbalik diatas nampan sebagai penyangga kaca yang diletakkan di
atasnya
3. Basahi laca dengan aquadest lalu letakkan plastic press diatasnya
4. Ratakan plastic sampai tidak ada gelembung disekitarnya untuk menghindari pecahnya
gel
5. Letakkan gel di atas plastik dan siram dengan aquadest lalu letakkan plastik ke dua di
atas gel
6. Siram dengan aquadest dan ratakan sampai tidak ada gelembung
7. Tunggu sampai kering selama ± 2 hari dan simpan di tempat yang gelap sebelum
dilakukan pembacaan
 IDENTIFIKASI PROFIL PROTEIN

A. Tujuan
Mendapatkan nilai berat molekul pada profil protein sehingga dapat dianalisis lanjut secara
deskriptif dan kualitatif terhadap pemberian perlakuan pada sampel.

B. Dasar Teori
Perhitungan Berat Molekul (BM) Protein dapat dilakukan dengan cara membuat kurva
baku Berat Molekul Protein. Kurva baku dibentuk oleh sumbu X yang merupakan nilai Rf
(factor retensi). Rf = jarak yang ditempuh oleh zat yang diteliti dibagi jarak yang ditempuh oleh
pelarut, sumbu Y menunjukkan log BM dari marker. Kurva baku Berat Molekul Protein hanya
bisa dibuat dari profil protein marker. Kurva baku yang terbentuk memiliki garis linear yang
menurun, hal ini disebabkan karena nilai berat molekul pita protein berbanding terbalik dengan
nilai Rf. Semakin banyak nilai berat molekul maka akan semakin sedikit nilai Rf.

KURVA BAKU BM PROTEIN

3
2.5
2 f(x) = − 1.31938261049031 x + 2.40577792847245
LOG MARKER

R² = 0.971676103009431 y
1.5
Linear (y)
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
NILAI RF

Sumber: Modul Biomolekuler 1

Cara menghitung berat molekul sampel yaitu dengan menggunakan rumus persamaan garis lurus
yang terdapat pada kurva. Informasi yang diperoleh dari sampel yaitu nilai RF (Sumbu X)
sehingga yang harus dicari adalah nilai Y (Log BM). Nilai Y yang diperoleh kemudian
dihilangkan notasi log untuk memperoleh berat molekul sebenarnya (kiloDalton/kDa).

C. Alat dan Bahan

 a. Alat :
- Bolpoin
- Penggaris
- Kertas marker sebagai acuan berat molekul
- Kalkulator
- HVS

b. Bahan :
Gel press hasil SDS-PAGE
D. Cara Kerja :
1. Gel yang telah kering diambil dan diperiksa marker proteinnya,
2. Sebelum menghitung tentukan berat molekul dari marker dengan cara :
 Menghitung Rf = jarak tempuh / jarak keseluruhan
Hasil menghitung Rf

Marker Jarak tempuh Jarak total (cm) X (Rf) Y (Log BM Marker)

(cm)
245 0,3 5 0,044 222,713426655267
180 0,5 5 0,089 194,255534027518
140 0,7 5 0,136 168,407566376276
100 1.1 5 0,218 131,271606450077
75 1,5 5 0,312 98,6613832377176
60 2,1 5 0,437 67,4873227746406
50 2,8 5 0,587 42,7870357531382
40 3,6 5 0,735 27,2923542681545
30 4,2 5 0,862 18,5556939145006
35 45 5 0,94 14,6407727605472

 Menghitung Y dengan cara me-Log-kan marker dengan hasil seperti tabel di bawah
 Masukkan ke dalam Microsoft Excel untuk memperoleh rumus persamaan

 Diperoleh rumus persamaan y = -ax + b.

Hasil Kurva Rumus persamaan:

bm protein
250

200
f(x) = − 221.728225761712 x + 195.280776095229
150 R² = 0.902091714296115
Axis Title

Y (Log BM)
Linear (Y (Log BM))
100

50

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Axis Title

 Rf dimasukkan ke rumus persamaan yaitu y = -a (Rf) + b.

 Nilai Y yang diperoleh kemudian dihilangkan notasi log untuk memperoleh berat
molekul sebenarnya (kiloDalton/kDa).

Hasil GelAnalyzer Marker

Hasil GelAnalyzer Sampel Protein
Hasil Perhitungan RF sampel:

1. RF Sampel (1)
Rumus: Y = -221, 73 x + 195, 28 (Didapat dari Kurva BM Protein)
RF= 0.028
 Y= -221, 73 (0, 028) + 195,28
= -2, 29091436 + 195, 28
= 192, 98908564

BM= 9. 75181918184288 kDa

2. RF Sampel (2)
Rumus: Y = -221, 73 x + 195, 28
RF= 0,369

Y= -221, 73 (0, 369) + 195, 28

= -81, 81837 + 195, 28
= 113, 46163

BM= 2, 89487622823491 kDa

3. RF Sampel (3)
Rumus: Y = -221, 73 x + 195, 28
RF= 0,697

Y= -221, 73 (0, 697) + 195, 2 8

= -57, 02740389 + 195, 28
= 138, 25259611
BM= 1, 78894138063228 kDa