Pengukuran Kandungan Proline dan Malondialdehid dan Aktivitas Enzim Antioksidan di

Indonesia
Daun Kepadatan Tertekan Tekan

[Abstrak] Kekeringan menekankan dampak negatif pertumbuhan tanaman kapas dan menginduksi
berbagai biokimia dan respon fisiologis pada tanaman kapas. Isi prolin dan enzim antioksidan dianggap
demikian terkait dengan menjaga struktur komponen seluler atau dengan melindungi fungsi seluler. Studi
tanggapan tanaman kapas terhadap stres kekeringan dan investigasi mekanisme kekeringan. Toleransi
sangat membantu untuk mengembangkan tanaman kapas toleran kekeringan. Di sini, kami
menggambarkan sebuah protokol di Penyelidikan respon tanaman kapas terhadap cekaman kekeringan
melalui pengukuran biokimia parameter termasuk aktivitas enzim antioksidan, konten prolin dan konten
malondialdehida (MDA).
Bahan dan Reagent

1. Centrifuge tubes (1.5 ml) (Corning, Axygen®, catalog number: MCT-150-C-S)

2. Benih Gossypium barbadense (Kapas)
3. Campuran tanah (vermiculite:humus = 1:1)
4. 1/2 media MS garam tanpa gula dan agar (Hopebio, nomor katalog: HB8469-12)
5. Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) (Sinopharm Chemical Reagent, katalog nomor:
20040618)
6. Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) (Sinopharm Chemical Reagent, katalog nomor:
20040818)
7. ddH2O
8. Nitrogen cair
9. Es
10. Ninhydrin (C9H4O3 · H2O) (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 30130212)
11. Asam Trichloroacetic (TCA) (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 80132618)
12. 5-sulfosalicylic acid dihydrate (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 10021516)
13. L-proline (Genview, nomor katalog: FL259)
14. Asam thiobarbituric (TBA) (Sigma-Aldrich, nomor katalog: T5500)
15. Sodium hydroxide (NaOH) (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 10019762)
16. EDTA-2Na (Sigma-Aldrich, nomor katalog: 27285)
17. L-methionine (Sigma-Aldrich, nomor katalog: V900487)
18. Nitroblue tetrazolium (NBT) (BEIJING DINGGUO CHANGSHEND BIOTEKNOLOGI, katalog
nomor: JN213)
19. Riboflavin (Sigma-Aldrich, nomor katalog: 47861)
20. Guaiacol (Sigma-Aldrich, nomor katalog: G5502)
21. 30% hydrogen peroxide (H2O2) (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 10011208)
22. Ethanol (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 10009259)
23. Glutathione berkurang (GSH) (Sigma-Aldrich, nomor katalog: G4251)
24. 1-kloro-2, 4-dinitrobenzena (CDNB) (Sigma-Aldrich, nomor katalog: C38702)
25. Asam asetat (Sinopharm Chemical Reagent, nomor katalog: 10000208)
26. 1/2 larutan MS (lihat Resep)
27. Larutan stok Na2HPO4 (lihat Resep)
28. Larutan stok NaH2PO4 (lihat Resep)
29. PBS (pH 7.0) (lihat Resep)
30. 2,5% acid-ninhydrin (lihat resep)
31. 3% asam sulphosalicylic (lihat Resep)
32. 10% TCA (lihat Resep)
33. 0.25% TBA (lihat Resep)
34. PBS (pH 7.8) (lihat Resep)
35. 1 mM EDTA-2Na (lihat Resep)
36. 130 mM metionin (lihat resep)
37. 750 μM NBT (lihat Resep)
38. 20 μM riboflavin (lihat Resep)
39. 0,2% guaiacol (lihat Resep)
40. PBS (pH 6.5) (lihat Resep)
41. 5 mM GSH (lihat resep)
42. 1,5 mM CDNB (lihat Resep)

Peralatan

1. Ruang pertumbuhan tanaman (25 ° C, 16 h / 8 jam fotoperiod, 10.000 lux, kelembaban 50-60%)
2. Mortar dan alu
3. Pot plastik (diameter 8 cm dan kedalaman 12 cm) (http://www.lyyyb.com/yingyangbo.html)
4. Keseimbangan elektronik (Sartorius, model: BAS124S-CW)
5. Sistem pemurnian ddH2O (Xiamen RSJ Scientific Instruments, model: Spring-S10)
6. Mesin pembuat es (Xueke, model: IMS-40)
7. Centrifuge (Eppendorf, model: 5810 R)
Spektrofotometer (Analytik Jena, model: ScanDrop® 250)
9. Mandi air (Changzhou Aohua Instrument, model: HH-1)
10. Pipet, 2-20 μl (Eppendorf, Eppendorf Research® plus, model: 3120000038)
11. Pipet, 20-200 μl (Eppendorf, Eppendorf Research® plus, model: 3120000054)
12. Pipet, 100-1,000 μl (Eppendorf, Eppendorf Research® plus, model: 3120000062)

Prosedur

1. Rendam biji kapas di air semalam pada suhu 28 ° C untuk mempromosikan perkecambahan biji.
Catatan: Benih berkecambah setelah 24 jam.

2. Keesokan harinya, beri benih kuman ke dalam pot yang diisi dengan campuran tanah (vermikulit:
humus = 1: 1), satu biji per pot Catatan: Pot dengan lubang kecil di bagian bawah penting untuk
membuang kelebihan air.

3. Pertahankan plantlet di plant growth chamber dengan kondisi terkendali 25 ° C dan 16 h light/8h
fotoperiod gelap pada intensitas cahaya 10.000 lux selama percobaan. Teratur air pot dengan media cair
1/2 MS (300 ml per pot) untuk memberi nutrisi pada tanaman. Catatan: Suplemen reguler 1/2 media MS
di dalam tanah diperlukan untuk pertumbuhan tanaman dalam pot. 7 ~ 10 hari untuk dua kotiledon untuk
sepenuhnya berkembang di bawah kondisi terkendali. Ini cocok waktu untuk melakukan operasi infiltrasi
pembungkaman gen yang diinduksi virus (VIGS) di kapas (Chen et al., 2015; Gao et al., 2011; Gu et al.,
2014).

4. Setelah 3-4 minggu, pot dengan planlet dua daun tiga disiram setiap hari selama tujuh tahun hari
sampai kejenuhan Catatan: Surplus air bisa bocor keluar dari lubang di bagian bawah, dan kondisi jenuh
Kelembaban di dalam tanah memberikan kandungan air yang sama sebelum pengobatan kekeringan.

5. Untuk penanganan kekeringan, planlet kemudian dicairkan air selama 35 hari, dilanjutkan dengan
penyiraman kembali sekali. Tujuh hari setelah perawatan penyiraman kembali, pabrik kapas dengan
setidaknya satu hijau yang tidak layu daun muda dan apeks tunas hidup dianggap sebagai "survival"
(Gambar 1A). Tingkat kelangsungan hidup adalah dihitung sebagai rasio jumlah tanaman bertahan
terhadap jumlah total tanaman yang diobati (Gambar 1B). Planlet yang disiram dengan baik dalam
kondisi pertumbuhan normal berfungsi sebagai kontrol.

6. Setelah 14 hari minum air, ambil satu atau dua daun muda untuk biokimia analisis parameter Catatan:
Untuk ekstraksi protein / enzim kasar, daunnya diambil dari posisi yang sama (daun kedua sampai ketiga
dari atas) untuk menghindari varians awal di antara garis yang berbeda.

7. Ekstrak protein / enzim.

a. Timbang 0,2 g daun segar dengan urat utama dari satu atau dua daun muda, giling dengan
mortar dan alu dalam nitrogen cair (Gambar 2A). Catatan: Biasanya, dua daun termuda yang
terkumpul cukup, dan ekstra dibuang. Daun muda dengan ukuran 3,5 x 3,5 cm ini sekitar 0,1-0,12
g, sedangkan yang berukuran 4,0 x 4,0 cm ini sekitar 0,16-0,19 g.

b. Homogenisasi serbuk daun dengan menambahkan 3 ml buffer PBS 100 mM (pH 7,8) (Gambar
2B). Catatan: Kecuali ditentukan lain, semua solusi kecuali untuk saham NaH2PO4 dan
Na2HPO4 Larutan dalam protokol ini disiapkan segar pada siang hari dan disimpan pada suhu
kamar selama pengujian. Untuk menyederhanakan protokol di sini, gunakan PBS bukan asam
sulfosalicylic 3% dan 0,25% asam thiobarbiturat yang dibuat dengan asam trikloroasetat 10%
untuk mengekstrak prolin dan malondialdehida. Penyangga PBS akan dibekukan setelah
menambahkan nitrogen cair. Homogenkan sampel dalam buffer PBS saat mulai mencair dalam 3-
5 menit.

c. Transfer homogenate ke dua 1,5 ml centrifuge tubes (Figure 2C) dan centrifuge pada 10.000 x
g selama 20 menit pada suhu 4 ° C. Catatan: Selama ekstraksi protein / enzim kasar, pastikan
semua sampel disimpan di bawah 4 ° C atau di atas es.

d. Transfer supernatan (Gambar 2D) ke tabung sentrifus baru untuk analisis lebih lanjut. Catatan:
Simpan ekstrak di es sebelum disimpan. Ekstrak protein / enzim kasar Aliquot ke dalam 1,5 ml
tabung sentrifus dan lepaskan tabung dalam nitrogen cair untuk segera membekukan sampel, lalu
simpan di suhu -80 ° C. Setiap aliquot hanya digunakan sekali dengan satu siklus pencairan.

e. Ukur konsentrasi protein kasar (mg / ml) pada supernatan dengan Analytik Jena ScanDrop 250
dengan metode spektrofotometri dengan Formula Warburg-Christian (protein): konsentrasi
protein (mg / ml) = 1,55 x A280 - 0,76 x A260 (Simonian dan Smith, 2006) (Gambar 3). Catatan:
Karena cahaya langsung dapat mempengaruhi linearitas absorbans versus konsentrasi, sampel
dengan absorbansi> 2,0 harus diencerkan lebih lanjut dalam buffer PBS untuk mendapatkan
absorbansi <2,0 (Simonian dan Smith, 2006).

8. Penentuan konten prolin

a. Persiapan reagen (lihat Resep) 100 mM PBS (pH 7.0) 2,5% asam ninhidrin 3% asam
sulfosalicylic
b. Siapkan larutan reaksi (untuk 40 reaksi) yang mengandung 10 ml 3% sulphosalicylic, 10 ml
asam asetat dan 20 ml asam ninhidrin 2,5%.
 c. Tambahkan 50 μl protein mentah / ekstrak enzim dari masing-masing sampel ke dalam larutan
reaksi 1 ml dalam 1,5 ml tabung sentrifugal. Larutan reaksi dengan 50 μl 100 mM PBS (pH 7,8)
berfungsi sebagai referensi.

d. Rebus campuran reaksi dalam bak air mendidih selama 15 menit. Perhatikan bahwa campuran
reaksi berubah menjadi merah setelah direbus.

e. Dinginkan campuran reaksi di atas es selama 5 menit.

f. Pipet 200 μl campuran reaksi dan ukur absorbansi pada 520 nm dengan Analytik Jena
ScanDrop 250.

g. Siapkan kurva standar L-proline untuk kuantifikasi sesuai dengan langkah di atas 8b-f (Gambar

h. Tentukan isi prolin sampel uji terhadap kurva standar L-proline. saya. Normalisasi konten
prolin dengan kandungan protein dalam sampel dengan unit "μg / mg protein".

j. Gambar 5A menunjukkan kandungan prolin menurun pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di
bawah kekeringan menekankan.

9. Penentuan kadar malondialdehida (MDA).

a. Persiapan reagen (lihat Resep) 10% TCA 0.25% TBA

b. Tambahkan ekstrak protein / enzim 100 μl mentah dari masing-masing sampel ke dalam
larutan KLB 1 ml 0,25% dalam tabung sentrifus 1,5 ml. 1 ml larutan TBA 0,25% dengan 100 μl
100 mM PBS (pH 7,8) berfungsi sebagai referensi.

c. Rebus campuran reaksi dalam bak air mendidih selama 15 menit. Perhatikan bahwa campuran
reaksi berubah menjadi merah setelah direbus.

d. Campurkan campuran reaksi di atas es selama 5 menit.

e. Pipet 200 μl campuran reaksi dan ukur absorbansi pada 532 nm dan 600 nm dengan Analytik
Jena ScanDrop 250.

f. Formula: MDA (protein nmol / mg) = (A532-A600) x Vr x (V / Vt) / 155 x 1.000 / Cp

A532: absorbansi pada 532 nm
A600: absorbansi pada 600 nm
Vr: volume campuran reaksi
V: total volume larutan enzim kasar
Vt: volume enzim kasar yang digunakan dalam tabung reaksi
Cp: konsentrasi protein kasar (mg / ml)
155: koefisien kepunahan MDA-TBA pada 532 (mM-1 cm-1)

g. Gambar 5B menunjukkan kandungan MDA meningkat pada kapas yang dibungkam GbMYB5
di bawah tekanan kekeringan.

10. Uji aktivitas SOD

 a. Persiapan reagen (lihat Resep)
100 mM PBS (pH 7,8)
1 mM EDTA-2Na
130 mM metionin
750 μM NBT
20 μM riboflavin
b. Siapkan larutan reaksi (untuk 30 reaksi) yang mengandung 30 ml 100 mM PBS (pH 7,8), 0,6
ml 1 mM EDTA-2Na, 2 ml 130 mM Met, 2 ml 750 μM NBT, dan 2 ml 20 μM Riboflavin.

c. Tambahkan larutan enzim 50 ml mentah dari masing-masing sampel ke dalam larutan reaksi 1
ml dalam 1,5 ml tabung sentrifus Larutan reaksi dengan 50 μl 100 mM PBS (pH 7,8) namun tidak
ada enzim kasar dalam kondisi gelap dan terang berfungsi sebagai kontrol I dan kontrol II.

d. Taruh tabung serta Control II dibawah cahaya, seragam, dengan intensitas cahaya 4.000 lux
selama 10-15 menit Sebaliknya, simpan Control I dalam kegelapan.

e. Pindahkan tabung menjauh dari cahaya dengan cepat.

f. Ukur absorbansi pada 560 nm dalam gelap dengan Analytik Jena ScanDrop 250. Gunakan
Kontrol saya sebagai referensi.

g. Formula: Aktivitas total SOD (unit: u / mg protein) = [(Ack-As) x V] / (0,5 x Ack x Vt) / Cp
Perlu diketahui: absorbansi pada 560 nm dari Kontrol II (terkena cahaya tanpa enzim kasar)

11. Uji aktivitas POD

a. Persiapan reagen (lihat Resep)

100 mM PBS (pH 7.0)
0,2% guaiacol
30% H2O2

b. Siapkan larutan reaksi (untuk 50 reaksi) dengan menambahkan guaiacol 28 μl 0,2% dalam 50
ml 100 Mm PBS (pH 7.0), panaskan dan aduk rata, tambahkan 19 μl 30% H2O2 setelah
pendinginan.
c. Tambahkan 50 μl 100 mM PBS (pH 7,8) dan 1 ml larutan reaksi ke dalam cuvette untuk
referensi (lihat video operasi). Catatan: Gunakan pipettor dan tip untuk mengeluarkan larutan dari
cuvette sebelum mengukur sampel berikutnya

Video 1. Penentuan aktivitas enzim dengan spektrofotometer ScanDrop 250 (Take POD sebagai
contoh). Video ponsel cerdas ini menyediakan keseluruhan prosedur aktivitas enzim penentuan
dengan spektrofotometer ScanDrop 250: bagaimana mengatur batch kerja, bagaimana caranya
menyimpan semua larutan reaksi dan ekstrak kasar, bagaimana mengatur parameter pengukuran
di perangkat lunak, cara menambahkan ekstrak kasar dan penyangga reaksi, dan sebagainya.
Penentuan aktivitas enzim CAT dan GST sama dengan POD.
Catatan: Untuk membuat larutan homogen untuk reaksi enzim, penting untuk menambahkan
ekstrak kasar (volume kecil) sebelum penyangga reaksi (volume besar) ke dalam cuvette.

d. Tambahkan larutan enzim 50 ml mentah dan 1 ml larutan reaksi ke dalam cuvette, dan segera
catat absorbansi dinamis pada 470 nm dengan Analytik Jena ScanDrop 250 setiap 15 detik
 selama 1 menit, mencari perubahan rata-rata yang stabil. Catatan: Regresi linier terbaik antara
absorbansi pada 470 nm dan waktu reaksi berada di dalam 75 detik (Gambar 6).

e. Formula: Aktivitas POD (unit: u / mg protein) = △ A470 x (V / Vt) / (0,01 x t) / Cp

△ A470: perubahan absorbansi pada 470 nm selama setiap 15 detik
V: total volume larutan enzim kasar
Vt: volume enzim kasar yang digunakan dalam tabung reaksi
t: waktu reaksi (menit)
Cp: konsentrasi protein kasar (mg / ml)
0,01: Satu unit POD didefinisikan sebagai jumlah enzim yang meningkat 0,01 absorbansi pada
470 nm per menit.

f. Gambar 5D menunjukkan aktivitas POD menurun pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di
bawah tekanan kekeringan.

12. Uji aktivasi CAT

a. Persiapan reagen
100 mM PBS (pH 7.0)
30% H2O2

b. Siapkan larutan reaksi (untuk 50 reaksi) dengan menambahkan 77,5 μl 30% H2O2 dalam 50
ml 100 mM PBS (pH 7.0).

c. Tambahkan 50 ml enzim mentah ke dalam 1 ml larutan reaksi di setiap tabung sentrifus 1,5 ml,
dan segera catat absorbansi dinamis pada 240 nm dengan Analytik Jena ScanDrop 250 setiap 15
detik selama 1 menit, cari perubahan rata-rata yang mantap. Solusi reaksi dengan 50 μl 100 mM
PBS (pH 7,8) berfungsi sebagai referensi.

d. Formula: Aktivitas CAT (unit: u / mg protein) = △ A240 x (V / Vt) / (0,1 x t) / Cp

△ A240: perubahan absorbansi pada 240 nm selama setiap 15 detik
V: total volume larutan enzim kasar
Vt: volume enzim kasar yang digunakan dalam tabung reaksi
t: waktu reaksi (menit)
Cp: konsentrasi protein kasar (mg / ml)
0,1: Satu unit CAT didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menurunkan 0,1 absorbansi pada
240 nm per menit.

e. Gambar 5E menunjukkan aktivitas CAT menurun pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di
bawah kekeringan menekankan.

13. Uji aktivasi GST

a. Persiapan reagen (lihat Resep)

100 mM PBS (pH 6.5)
5 mM GSH
1,5 mM CDNB

b. Siapkan larutan reaksi (untuk 50 reaksi) dengan menambahkan 20 ml 5 mM GSH dan 40 ml

1,5 mMCDNB.
c. Tambahkan larutan enzim 50 μl kasar ke dalam 1 ml larutan reaksi di setiap sentrifugasi 1,5 ml
tabung, dan segera catat absorbansi dinamis pada 340 nm dengan Analytik Jena ScanDrop 250
setiap 15 detik selama 1 menit, cari perubahan rata-rata mantap. Reaksi Larutan dengan 50 μl 100
mM PBS (pH 7,8) berfungsi sebagai kontrol dan ddH2O berfungsi sebagai referensi.

d. Formula: Aktivitas GST (unit: u / mg protein) = (△ A340s - △ A340ck) x (V / Vt) / t / Cp

△ A340: perubahan A340 tabung sampel kandidat selama setiap 15 detik
△ A340ck: perubahan kontrol A340 selama setiap 15 detik
V: total volume larutan enzim kasar
Vt: volume enzim kasar yang digunakan dalam tabung reaksi
t: waktu reaksi (menit)
Cp: konsentrasi protein kasar (mg / ml)
Satu unit GST didefinisikan sebagai jumlah enzim yang meningkatkan 1 absorbansi pada 340 nm
per menit

e. Gambar 5F menunjukkan aktivitas GST menurun pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di
bawah tekanan kekeringan.
Penyajian Data

Gambar 1. Fenotip (A) dan tingkat ketahanan hidup (B) planlet kapas yang dibungkam GbMYB5 di
bawah perawatan pemotongan air. A. Fenotip tanaman kapas dalam menanggapi air-menahan perawatan
WT: planlet kapas tipe liar; VIGS: planlet kapas agroinfiltrasi dengan vektor pCLCrVA-GbMYB5 dan
pCLCrVB untuk membungkam gen GbMYB5 (Chen et al., 2015); CK: planlet kapas agroinfiltrasi
dengan vektor pCLCrVA kosong dan pCLCrVB.
0 d: awal pengobatan pemotongan air; 35 d: 35 d post water -holdhold treatment;
Kontrol: kondisi pertumbuhan normal. B. Tingkat kelangsungan hidup planlet kapas setelah 35 d air
minum dilakukan pengobatan. Kontrol: kondisi pertumbuhan normal; Kekeringan: 35 d post water –
holdholding pengobatan; Nilai kelangsungan hidup disajikan sebagai sarana ± SE dari tiga replikasi
biologis dengan delapan tanaman per ulangan (** P <0,01; t-test).
Gambar 2. Ekstraksi protein kasar / enzim dari daun kapas dengan lebar 14 d post waterwithholding
pengobatan.
A. Menggiling jaringan daun dengan mortar dan alu dalam nitrogen cair.
B. Homogenkan bedak daun dengan buffer PBS.
C. Tissue homogenat dalam tabung sentrifugasi sebelumnya
D. Hasil Supernatan dan pelet setelah sentrifugasi.
Gambar 3. Perhitungan protein dengan spektrofotometer ScanDrop 250.
A. Mesin mulaiScanDrop 250 dan perangkat lunaknya FlashSoft Pro.
B. Pilih posisi pengukuran "Standard MP"dan modul "Bio method" di jendela Modul, atur "Flash
number" (3), "Number of akumulasi "(10) dan aktifkan" Dark correction ".
C. Pilih "Serial measurement", masukkan jumlah sampel di bawah "Siklus" di jendela MP Standar.
D. Aktifkan Formula yang diinginkan Warburg-Christian (protein) dengan mencentang kotak di jendela
"Bio", lalu tekan tombol start.
E. Masukkan cuvette untuk referensi (100 mM PBS buffer, pH = 7,8) sesuai instruksi.
F. Ukur absorbansi larutan kasar sesuai instruksi. Poin kunci dari operasi ditandai dengan lingkaran
merah.

Gambar 4. Kurva standar antara absorbansi pada muatan 520 nm dan L-proline. Kandungan seri L-prolin
(0, 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 μg) dilarutkan dalam 0,5 ml ddH2O adalah ditambahkan ke dalam 1 ml
larutan reaksi untuk mengukur absorbansi pada suhu 520 nm. Regresi linier diamati antara nilai
absorbansi pada kadar 520 nm dan L-prolin pada 0-30 μg (R2 = 0,9935). Nilai yang tertera adalah dua
eksperimen independen.
Gambar 5. Analisis metabolit dan aktivitas enzim dalam katun GbMYB5 yang dibungkam di bawahnya
stres kekeringan
A. Kandungan prolin menurun pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di bawah tekanan kekeringan.
B. Kandungan MDA meningkat pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di bawah tekanan
kekeringan. Kegiatan SOD
C. POD
D. CAT
E. GST
F. Penurunan pada kapas yang dibungkam GbMYB5 di bawah tekanan kekeringan. CK: planlet
kapas agroinfiltrasi dengan vektor pCLCrVA kosong dan pCLCrVB; VIGS: planlet kapas
agroinfiltrasi dengan vektor pCLCrVA-GbMYB5 dan pCLCrVB untuk membungkam Gen
GbMYB5 Nilai adalah mean ± SE dari replikasi biologis (n ≥ 5) (* P <0,05; ** P <0,01; t-test).
Gambar 6. Regresi linier antara absorbansi pada 470 nm dan waktu reaksi. Itu Nilai absorbansi POD
secara otomatis dikumpulkan dalam interval 15 detik dan sampai 150 detik. Garis biru dan garis merah
mewakili regresi linier antara absorbansi POD pada 470 nm dan waktu reaksi dalam waktu 150 detik atau
60-75 detik. Pengujian sampel 4 POD (4 sub-panel) menunjukkan regresi linier terbaik antara absorbansi
pada 470 nm dan waktu reaksi dalam waktu 75 detik.
Resep
Catatan: Nilai pH buffer PBS harus diverifikasi dengan pH meter sebelum digunakan.
1. 1/2 larutan MS
Larutkan 2,47 g 1/2 garam media MS dalam 1.000 ml ddH2O

2. Larutan stok 200 mM Na2HPO4

Larutkan 53,65 g Na2HPO4.7H2O dalam 1.000 ml ddH2O
Simpan dalam 4 ° C sebelum menggunakan

3. Larutan stok 200 mM NaH2PO4

Larutkan 27,8 g NaH2PO4.H2O dalam 1.000 ml ddH2O
Simpan dalam 4 ° C sebelum menggunakan

4. 100 mM PBS (pH 7.0)

61 ml 200 mM larutan Na2HPO4
39 ml 200 mM larutan NaH2PO4
100 ml ddH2O

5. 2.5% acid-ninhydrin
Larutkan 1.250 g ninhidrin dalam 30 ml asam asetat dan 20 ml 100 mM PBS (pH 7.0) dengan
sterring dalam
Pemandian air 70 ° C
Simpan dalam 4 ° C sebelum menggunakan

6. Asam sulphosalicylic 3%
Larutkan 3.496 g asam 5-sulfosalisilat dihidrat dalam 100 ml ddH2O

7. TCA 10%
Larutkan 10 g TCA dalam 100 ml ddH2O

8. 0,25% TBA
Larutkan 0.125 g TBA dalam 5 ml 1 mol / L NaOH
Tambahkan ke 45 ml 10% TCA
Simpan dalam 4 ° C sebelum menggunakan

9. 100 mM PBS (pH 7,8)

91,5 ml 200 mM larutan Na2HPO4
8,5 ml 200 mM larutan NaH2PO4
100 ml ddH2O

10. 1 mM EDTA-2Na
Larutkan 0,037 g EDTA-2Na dalam 100 ml ddH2O

11. 130 mM metionin

Larutkan 0,970 g metionin dalam 50 ml 100 mM PBS (pH 7,8)
Simpan dalam 4 ° C sebelum menggunakan
12. 750 μM NBT
Larutkan 0,031 g NBT dalam 50 ml 100 mM PBS (pH 7,8)
Terus dalam kegelapan
 13. 20 μM Riboflavin
Larutkan 0,007 g riboflabin dalam 100 ml ddH2O
Terus dalam kegelapan

14. 0,2% guaiacol

Larutkan 0,1 g guaiacol dalam 0,5 ml etanol
Tambahkan ke dalam 50 ml 100 mM PBS (pH 7.0)
Terus dalam kegelapan

15. 100 mM PBS (pH 6.5)

31,5 ml 200 ml larutan Na2HPO4
68,5 ml 200 mM larutan NaH2PO4
100 ml ddH2O

16. 5 mM GSH
Larutkan 0,077 g GSH dalam 50 ml 100 mM PBS (pH 6.5)

17. 1,5 mM CDNB

Larutkan 0,015 g CDNB dalam 5 ml etanol
Tambahkan ke dalam 45 ml 100 mM PBS (pH 6.5)

Ucapan Terima Kasih

Protokol ini diadaptasi dari artikel penelitian: Chen et al. (2015). Pekerjaan ini didukung oleh National
Natural Science Foundation of China [hibah No.31371930]; Ilmu Pengetahuan Nasional dan Proyek
Utama Teknologi untuk Pembiakan Transgenik, China [memberikan No.2014ZX0800501B]; Inovasi
Independen Ilmu Pertanian di Provinsi Jiangsu, China [memberikan No.CX (15) 1005].
References
1. Chen, T., Li, W., Hu, X., Guo, J., Liu, A. and Zhang, B. (2015). A cotton MYB transcription factor,
GbMYB5, is positively involved in plant adaptive response to drought stress. Plant Cell Physiol 56(5):
917-929.
2. Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C. M., He, P. and Shan, L. (2011). Silencing GhNDR1 and
GhMKK2 compromises cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J 66(2): 293-305.
3. Gu, Z., Huang, C., Li, F. and Zhou, X. (2014). A versatile system for functional analysis of genes and
microRNAs in cotton. Plant Biotechnol J 12(5): 638-649.
4. Simonian, M. H. and Smith, J. A. (2006). Spectrophotometric and colorimetric determination of protein
concentration. Curr Protoc Mol Biol Chapter 10: Unit 10 11A.