03/10/2014

UJI-UJI
ANTIMIKROBA
KIMIA BIOESAI
PS-S2 KIMIA IPB
2014

Uji Suseptibilitas Antimikrobial

► Metode Difusi
 Menggunakan cakram filter, mengandung sejumlah antibiotik
dengan konsentrasi tertentu

► Metode Dilusi
 Berbagai konsentrasi antibiotik dalam media kaldu
 Umumnya penentuan MIC dan MBC

Dr.T.V.Rao MD 2

1
 03/10/2014

Metode untuk Mendeteksi Antibiotik

► Metode Diffusi: The Kirby-Bauer test

-Metode ini berdasarkan difusi antibiotik pada agar yang

diinokulasi mikroorganisme.

- Efek dari antibiotik diekspresikan dengan terbentuknya suatu

zona pertumbuhan yang terhambat.

Pengukuran sensitivitas mikroorganisme

terhadap antibiotik
► Pengukuran dengan Uji Difusi Cakram (disk
diffusion test).
► Larutan antibiotik/sampel uji dengan konsentrasi
tertentu dikeringkan pada kertas cakram.
► kemudian diletakan pada permukaan agar yang
sudah dioleskan mikroba yang standar.

2
 03/10/2014

Mengapa harus memakai metode standar?

Faktor-faktor yang mempengaruhi diameter zona

1. Diffusi antibiotik
2. Medium
3. Kedalaman agar
4. Hidrasi medium
5. Ukuran Inokulum
6. Kecepatan tumbuh inokulum
7. Waktu Pre-inkubasi
8. Waktu Inkubasi
Metode paling umum dan standar:
Kirby-Bauer (NCCLS),
Calibrated Dichotomous Sensitivity (CDS) Method

► Efektivitas antibiotik
berhubungan dengan zona
inhibisi pertumbuhannya.
Makin luas diameternya, makin
potensi sample antibiotik tsb..

R
I
S
R - Resistant
I - Intermediate
S - Susceptible

3
 03/10/2014

Metode Agar Difusi Cakram

► Medium Mueller Hinton ketebalan 4 mm

pH 7.2 to 7.4

► CakramAntibiotik storage -20oC minimum

temperature

► Inokulum McFarland 0.5 (108 bacteria/mL)

► Inkubator temperatur 35oC

► Atmosphere udara ambient

Galur Standar utk

quality assurance
Presisi dan akurasi dilakukan
dengan menggunakan galur
terkontrol
Suseptibilitasnya sudah
diketahui.
Galur Standard
 Staphylococcus aureus
ATCC 25923
 Escherichia coli ATCC 25922
 Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853

4
 03/10/2014

Prosedur
 Persiapkan kultur murni berumur 18-24 jam
pada medium non selektif.
 Sesuaikan kekeruhan sekitar standar
kekeruhan 0.5 McFarland

Sample 0.5 McFarland Standard

Dr.T.V.Rao MD 9

Pindahkan koloni secara aseptik utk perbanyakan

Pilih 4-5 koloni murni dari plat agar

dan pindahkan ke dalam tabung
media kaldu spt kaldu tryptic-soy.
Inkubasi semalam pada 35°C
atau sampai diperoleh kekeruhan
sesuai standar 0.5 McFarland,

Dr.T.V.Rao MD 10

5
 03/10/2014

McFarland 0.5 dan tabung berisi mikroorganisme yang disesuaikan

kekeruhannya

Dr.T.V.Rao MD 11

Inokulasi pada lempeng secara merata

► Dalam 15 menit setelah

distandarkan, ambil dengan
aplikator steril dan tanam
pada lempeng agar Muller
Hinton secara rotasi berulang
kali. Yakinkan utk menyerap
kelebihan cairannya pada sisi
lempeng.
► Biarkan 3-5 menit agar
kelebihan cairan mengering
atau terabsorb.

Dr.T.V.Rao MD 12

6
 03/10/2014

Memilih cakram antibiotik dan memasangkannya

Select disks

Dr.T.V.Rao MD 13

HATI- HATI
► Medium agar harus pH 7.2 to 7.4 pada suhu ruangan.
Permukaan harus lembab tanpa tetesan air.
► Cakram antibiotik harus disimpan pada 8°C atau disimpan
pada -14°C
► Sebelum digunakan biarkan dahulu pada suhu ruangan
► Jangan gunakan yang sudah kadaluarsa
► Inkubasi pada 32 oC selama 16-18 jam

Dr.T.V.Rao MD 14

7
 03/10/2014

Hasil
 Antibiotik berdifusi ke dalam agar
 konsentrasi antibiotik terus berkurang menjauh dari
cakramnya
 Setelah inkubasi, perhatikan daerah bening pada
permukaan agar dan disebut sbg zona inhibisi

Bacterial growth
incubation

Dr.T.V.Rao MD Zone of inhibition

15

Masalah dengan uji cakram

inokulum sesuai dan inokulum yang kebanyakan

16 Dr.T.V.Rao MD

16

8
 03/10/2014

Masalah dengan difusi cakram

cakram yang dipasang dengan benar cakram dipasang tidak tepat

Dr.T.V.Rao MD 17

Metode Dilusi
► Minimum Inhibition Concentration (MIC)
 Konsentrasi terendah suatu antimikroba yang
menghambat pertumbuhan bakteri.

► Minimum Bactericidal Concentration (MBC) or Minimum

Lethal Concentration (MLC)
 Konsentrasi terendah dari suatu antimikroba yang
menunjukkan kurang dari 0.1% inokulum awal masih
bisa bertahan

18

9
 03/10/2014

Penentuan MIC dengan metode dilusi

kaldu
► Tabung berisi kaldu dengan larutan antibiotik yang
diencerkan dua kali lipat dan inokulum standar
► Setelah inkubasi semalam, MIC ditentukan berdasarkan
tabung pertama pertumbuhan yang dihambat.
► Makin resisten suatu organisme, berarti MIC makin tinggi.

Metode Dilusi Kaldu

►Prosedur
Buat pengenceran dua kali dari antibiotik dalam
kaldu Mueller-Hinton, Tryptic Soy Broth
 Inokulasi bakteri , inkubasi semalam.
►kontrols: tanpa inokulum, tanpa antibiotik
 Tervisualisasi kekeruhan MIC
 Kemudian subkultrul tabung yang tidak keruh
selama semalan.
 Ada pertumbuhan (bacterial count)  MBC
20

10
 03/10/2014

Antibiotik diencerkan pada berbagai konsentrasi untuk

menguji MIC

Grafik hasil uji MIC

11
 03/10/2014

Minimum Inhibitory
Concentration (MIC)

Minimum Bactericidal
Concentration (MBC)

Prinsip Uji Suseptibilitas

Dr.T.V.Rao MD 24

12
 03/10/2014

Metode Dilusi Kaldu

► 100% dari konsentrasi awal bakteri
 = 5*105 CFU/ml

► 0.1%
 = [(5*105)*0.1]/100 CFU/ml
 = 500 CFU/ml

► Jumlahbakteri sebaiknya kurang dari 5 CFU (colonoy forming unit)

pada plat untuk kultur dengan 0.01 ml
 500*0.01 = 5 CFU
25

Antimicrobial Gradient Testing

E-test®

Read plates
after
recommended
Incubation
Read MIC
where elipse
intersects
scale

13