Pengembangan dan

Validasi Metode
Analisis Kimia
SEMINAR ILMIAH DAN FORUM DISEMINASI
HASIL RISET PROM BADAN POM
Jakarta 24 Mei 2017

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
E-mail: yuwono05@yahoo.com

1
Laboratorium Pengujian BPOM

Sampel Preparasi sampel

Tahap Pra analisis Uji Kesesuaian

QA Sistem
ISO 17025
Data Integrity
OOS Investigation Analisis
CAPA Laboratorium (QC)
Laboratory Safety
Analisis
HPLC
Tahap Pasca analisis

Dokumentasi
(record) Pelaporan hasil Analisis Data dan 2
interpretasi
 Validitas Hasil Pengujian

Analis Akomodasi & Lingkungan

Pendidikan Baku Pembanding,
Reagensia
Pelatihan
Pengalaman

Hasil
Tidak Valid
Preparasi sampel
Verifikasi Kinerja
Presisi

Validitas Kualifikasi

Linieritas
Linieritas Akurasi, LOD,
LOQ Alat/Instrumen Sensitvitas
Selektivitas UKS Kalibrasi
Metode Analisis
Metode Analisis

2 Adopsi
1
Metode Baku/Resmi Metode Baku
Metode tidak di suatu
baku Dikeluarkan oleh Laboratorium
Metode hasil Lembaga Resmi Pengujian
penelitian di Berlaku secara luas
Jurnal Ilmiah Contoh: Metode
Metode hasil satu Kompendial/
Lab (Single Farmakope;
Laboratory AOAC, ISO, USP dll.
validation)

4
 Metode Analisis

Pengembangan Optimasi Pre-validasi

Revalidasi Validasi

Verifikasi metode

Implementasi
(rutin)

5
USP Chapter 1224, 1225, 1226

6
Metode Analisis
Metode Tidak baku
Metode Metode Baku di luar
Baku (kompendial) ruang lingkup

Verifikasi Validasi

Implementasi metode di Laboratorium

Harus menggunakan metode yang telah
divalidasi/diverifikasi
Method Adjustment USP

Method Adjustment (USP Ch. 621)

Jika hasil Optimasi dan

tidak Penyesuaian Verifika
Verifikasi si
Metode memenuhi metode
kriteria Metode
Kompendial (Method Okay!
Tailing peak Adjustment)
Low resolution
Bad recovery Perubahan kondisi:
Kec. Fase gerak
Komposisi fase
gerak
Suhu
Panjang kolom
Ukuran partikel
Dsb.
Validasi Metode (USP Ch. 1225)

9
Verifikasi Metode (USP Ch 1226)

10
Kategori Metode Analisis

Penetapan kadar komponen utama

dalam bahan baku obat atau bahan
aktif dalam sediaan farmasi

Penetapan cemaran atau hasil

Degradasi
Penetapan kuantitatif (II a)
dan uji batas/kualitatif (II b)

Penetapan karakteristik sediaan

(disolusi, pelepasan obat, dll)

Metode analisis untuk identifikasi

11
 Strategi Pengembangan Metode

Tentukan jenis dan tujuan analisis

Analit: tunggal atau kombinasi?; Konsentrasi analit?
At Your Desk

Kualitatif, kuantitatif atau preparatif?

Kriteria Penerimaan Pemisahan?
Kumpulkan informasi pustaka tentang analit
dan sampel
Sifat fisikokimia analit dan Preparasi sampel
Memilih Metode Analisis

Percobaan awal (orientasi) di Laboratorium

Optimasi metode
Laboratory
Laboratory

komposisi fase gerak, pH, kec. alir, analitik, elusi,

suhu dll.
the
In the

Validasi metode
In
Studi Pustaka
(Bahan, Sampel dan Metode Analisis)

Perlu diketahui sifat fisika dan Sifat kimia

Analit
Analit:
Tunggal atau campur
Konsentrasi analit: besar atau rendah
Jenis dan komponen matriks sampel
Kemungkinan interaksi analit dan matriks
sampel
Analit khusus: Senyawa Chiral, Protein,
Gula dll.
Kenali dulu Sifat Fisikokimia Analit

Struktur
Kimia
Bobot Molekul Isomer
Stabilitas
pKa Polaritas
Kelarutan Volatilitas
Log P Toksisitas
MSDS
Absorpsi UV
Chromophoric
Non
chromophoric

Apa ciri-ciri molekul polar?

Analit dan Matriks Sampel yang rumit !

Analit
Sangat
Polar Campuran Analit
Analit Chiral,
polar +
related substances
Non Polar

Analit Kadar Analit

Sangat
tidak stabil rendah

Matriks sampel Campuran Analit

sangat kompleks Kadar Sangat tinggi
interaksi analit dan Sangat rendah
dan matriks
Memilih Teknik/Metode Analisis

Metode Hyphenated
Spektroskopi Kromatografi Elektrokimia
klasik Techniques

Spot Potensio-
KLT- metri,
test, Spektrofoto Spektroden
metri UV- Elektrode
Volumetri sitometri, Selektif Ion GC-MS,
/ Vis, IR, GC, HPLC,
Sensor LC-MS
AAS, ICP UHPLC,
Gravimet dll. Kimia
ri CE
Biosensor
Macam Kromatografi berdasarkan mekanisme

Kromatografi adsorpsi
(adsorption
chromatography)
Kromatografi Partisi
(partition
chromatography)
Kromatografi ion
(ion Chromatography)

Size Exclusion Chromatography

(SEC)
Molecular Kromatografi Permeasi Gel;
basis Kromatografi Filtrasi Gel
separation

Affinity Chromatography
HPLC berdasarkan polaritas fase diam dan fase gerak

Fase diam
Ionik Ion
Exchange

Polar Normal
Phase

Non Reversed Ion

Polar Phase pairing

Fase gerak
Non Ionik
Polar
Polar
Analit polar vs non polar

RP-HPLC
Sesuai untuk analit non polar
Analit polar tidak teretensi

Pemisahan analit polar pada RP-

HPLC
Pengaturan pH fase gerak (ion suppression)
Ion Pair HPLC
Ion-Exchange
HILIC
pH Fase Gerak

Untuk senyawa non ionik (netral) pH fase gerak

tidak mempengaruhi retensi
Untuk pemisahan senyawa ion/terionkan pH fase
gerak perlu diatur
pH fase gerak mempengaruhi ionisasi analit
Asam organik
Basa organik
Pada RP-HPLC dilakukan ion suppression
Menekan ionisasi melalui pengaturan pH fase gerak
sehingga analit sebanyak mungkin dalam bentuk
tak terionisasi
Penggunaan Dapar

Fungsi dapar: Menjaga pH fase gerak

selama analisis
Pada pemisahan analit ionik, jika
kapasitas dapar terlalu rendah:
Waktu retensi berubah-ubah
bentuk peak tidak simetris

21
Kapasitas Dapar

Ditentukan oleh pH, pKa dan konsentrasi

dapar
Untuk pemisahan yang baik, dapar dipilih
pada rentang pKa 1
Konsentrasi dapar: 10-50 mM. Umumnya
dipakai konsentrasi 25 mM
Konsentrasi > 50 mM
kapasitas dapar meningkat, tetapi mungkin tidak
larut pada fase gerak (organic modifier yang
tinggi)
Dapat merusak komponen instrumen HPLC
22
Ion Pair HPLC

Jika teknik ion-suppression tidak berhasil

digunakan teknik pasangan ion.
Atur pH sehingga analit dalam bentuk terionkan.
Contoh: untuk asam lemah pH basa (7-8)
Fase gerak ditambah reagen pasangan ion agar
analit lebih teretensi dalam kolom dan pemisahan
lebih selektif
Contoh reagen pasangan ion:
Untuk analit basa (Sodium hexane sulfonate, Sodium
octansulfonate dll.)
Untuk analit asam (Tetrabutylammonium hydroxide )
Reagen pasangan ion berinteraksi dengan analit
membentuk pasangan ion yg bersifat lebih non polar
daripada bentuk ion lebih retensi dalam kolom.
Makin panjang rantai alkil (gugus non polar) pada
reagen pasangan ion retensi makin kuat
No ion-pair +30 mM +30 mM
sod.hexansulfonat sod.octansulfonat
Kemurnian ion-pair reagent

Semua komponen Fase

gerak harus memenuhi
syarat kemurnian yang
tinggi sehingga drift
baseline dapat dihindari.
Termasuk ion-pair
reagents.
KOLOM HPLC

Karakteristik
Tipe Kolom Packing
Ligand
Internal Diameter
Kolom HPLC
Panjang Conventional
Endcapped
Ukuran Partikel High/Ultra Pure Silica
Ukuran Pori Stable Bond
Area permukaan
Residu silanol
Kemurnian
Susunan Fase Diam

Column packing terdiri dari partikel sangat

kecil yang ditekan kuat ke dalam kolom
Bahan umumnya berupa silika
Pada kolom fase terbalik, permukaan silika
ditutup oleh molekul organik/ fase terikat
(bonded phase)
Bagian dinding pori lapisan organik terdiri
dari rantai alkil yang terikat pada permukaan
silika menyerupai bulu-bulu
Tipe packing material
Fasa Diam (USP)

Kelompok fase diam HPLC:

Berdasarkan sifat kimia rantai bonded
phase :
L1: C18 / octadecyl / ODS
L7: C8 / octyl
L8: NH2
L9: SCX
L10: CN
L11: Phenyl
L13: Trimethylsilyl/methyl/TMS
L14: SAX
Kolom HPLC

Bentuk Partikel
Spherical atau irregular
Partikel spherical
mengurangi tekanan dan kolom
lebih awet

Ukuran Partikel
Umumnya 3-10m
Makin kecil ukuran partikel,
makin tinggi efisiensi
Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Efisiensi Kolom berbanding lurus dengan panjang kolom dan

berbanding terbalik dengan ukuran partikel
Fase Normal Fase terbalik
Residual Silanol

Pada derivatisasi silika: Karena efek

halangan ruang, tidak semua gugus
silanol mengalami derivatisasi, sehingga
masih ada gugus silanol tersisa (Residual
silanol)
Residual silanols menyebabkan timbulnya
puncak yang berekor (tailing) khususnya
untuk analit asam dan basa
Untuk menghilangkan residual silanol
dilakukan proses endcapping
penggunaan molekul rantai pendek
Contoh: RP-18 endcapped
 Pemakaian RP-HPLC endcapped

Kolom RP-18 endcapped menurunkan

ikatan hidrogen yang terjadi antara analit
dan fase diam.
Dapat mengurangi tailing dan pelebaran
puncak, khususnya untuk analit asam dan
basa organik.

34
Monofunctional surface modification of SiO2
OH
OH
Si
O
Si OH CH3 CH2
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2
O C6H13
Si X Si CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2
OH CH3
O
O Si monofunctional
OH
modification

OH CH3
CH3 OH
O Si C18H37 O Si
Si
O
CH3 Endcapping Si CH3
CH3
O
Si CH3 Endcapping
Si OH Si O
O CH3
O
Si O CH3 Si CH3
O
O Si C18H37 O Si
O Si CH3 O Si CH3 CH3
OH O
Si CH3
CH3
 HPLC Columns: Bonding Types

CH3 R
monomeric
OH + X Si (CH2)17 CH3 Si (CH2)17 CH3
bonding
CH3 R

OH CH3 O CH3
polymeric
+ X Si (CH2)17 CH3 Si
bonding
OH X O (CH2)17 CH3

Polymeric bonding increased column stability; higher sample loading.

Monomeric bonding increased mass transfer rates, higher column efficiency,
and faster column equilibration.
Kolom HPLC

Ukuran Pori-pori
Bervariasi antara 60-
10,000
Makin besar pori-pori
analit molekul besar
dapat tertahan lebih
lama.
Pilih 150 untuk
sampel BM 2000.

Cocok untuk molekul BM < 2000

 Kolom Monolitik

Batangan silika monolitik Kecepatan alir dapat

ditingkatkan dengan resolusi yang baik

Pori-pori besar kecepatan alir dapat ditingkatkan

waktu analisis makin cepat
Core Shell HPLC Columns
Core shell vs fully porous silica
particles
High Pure Silica

Spherical particles
Almost no metal impurities (< 5 ppm)
Excellent peak symmetry
Extended stability: pH range 1.5 to 10.5

irregular

spherical

monolithic

41
 High Pure Silica

The Difference - Metal Content

Metal content in ppm

Sodium Calcium Magnesium Iron Aluminium

irregular 340-400 1300 160-220 20-25 15-20

Sperical 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140

High Pure Silica 1 1 3 1 1

 High Pure Silica RP-18 endcapped
O OH O OH
OH

Chelating Agents
O OH O OH

Purpurin Quinizarin
1. High Pure Silica
conventional RP-18 silica 2.

2.

0 5 10 0 5 10
Chromatographic conditions:

Mobile phase: Methanol / 20 mM Phosphate

buffer
pH 3,0; 75:25 (v/v)
Flow rate: 1.0 ml/min
Detection: UV 254 nm
Temperature: 30 C
Sample: 1.) Purpurin
2.) Quinizarin
High Pure Silica

Influence of improved surface modification

Conventional RP-18 silica
1
. N N CH3

0 20 40

Pyridine (1) 2-Methylpyridine (2)

High Pure Silica RP-18 e
1 Chromatographic Conditions:
2 Mobile phase: Methanol / Water
55:45 (v/v)
Flow rate: 1.0 ml/min
Detection: UV 254 nm
Temperature: 35 C

0 20 40
High Pure Silica RP-18 endcapped

Application Procainamides
3

High Pure Silica RP-18e

0 7,5 15

3
1

conventional RP-18 silica

2

0 7,5 15
Perbedaan Selektivitas dari RP C-18

Konsekuensi :
Hasil pemisahan
dari suatu
publikasi di
jurnal/Farmakope
tidak selamanya
dapat diulang
dengan hasil yang
sama.
Kolom HILIC

Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography =

Hydrophylic Interaction Chromatography
Aqueous Normal Phase

Mirip HPLC fase normal tetapi

menggunakan fase gerak
mengandung air

Fase diam bersifar polar, fase gerak

bersifat polar (campuran Acetonitril +air)
47

Dapat meretensi senyawa yang

atau sangat polar/hidrofil (log P negatif)
Jenis Fase diam HILIC

Silica
Amine
Diol
Amide
Zwitterionic

HILIC
Istilah untuk membedakan dengan Normal Phase
HPLC

48
Kelemahan Kolom Silika

Stabil pada rentang pH terbatas (pH 2-8).

Kecuali kolom silika yang modern.
Pada pH < 2, memecah ikatan kimia bonded phase
dan silika
Pada pH > 8, silika terlarut
Pada pH > 9 dapat terjadi kolaps dengan
menurunnya efisiensi secara drastis dan
timbulnya puncak asimetri (tailing atau
fronting).
Polymer based columns

Fase diam bahan polimer stabil pada

rentang pH yang lebih lebar (pH 1 13)
Berupa partikel polimer berpori misalnya
divinylbenzene-cross-linked polystyrene
Dapat digunakan untuk pemisahan analit
basa kuat
memiliki sifat hidrofobik yang kuat sehingga
dapat digunakan untuk pemisahan senyawa
yang sangat hidrofil
Memilih Detektor HPLC
HPLC Detectors:
UV-Vis Absorbance Detector
Photodiode array Detector (PDA = DAD)
Refractive Index Detector (RID)
Fluorescence Detector (FLD)
Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
Electrochemical Detector (ECD)
Conductivity Detector
Radiometric Detector
Hyphenated Systems
LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR

Pilihan pertama UV/Vis atau DAD

Untuk analit non chromophor RID atau ELSD
Memilih Panjang Gelombang Detektor UV
Pemilihan
Panjang
Gelombang
(UV)

?
Karakteristik kinerja metode USP and ICH

Presisi
Akurasi
Batas Deteksi
Validasi
Batas Kuantitasi
Metode
Selektivitas/Spesifisitas
Linieritas
Rentang
Robustness/Ruggedness
System Suitability Test
54
Akurasi dan Presisi Metode

Akurasi No Akurasi Yes Akurasi Yes Akurasi No

Presisi Yes Presisi Yes Presisi No Presisi No
(Hasil dirata-rata)

55
Parameter validasi

56
 Source: Huber
57
Selektivitas vs. Spesifisitas

USP dan ICH menggunakan istilah Specificity

IUPAC dan AOAC menggunakan istilah

Selectivity

AOAC: Specificity highest selectivity

58
Specificity (ICH/USP)
Specificity (USP/ICH):
The ability to assess unequivocally the analyte in
the presence of components to expected to be
present, such as impurities, degradation
products, and matrix components.

Selectivity describes the ability of an analytical

method to differentiate various substances in a
sample.
59
 Spesifik dan Selektif
Selektif:
Mampu membedakan antara senyawa analit dengan
derivat/degradan/ metabolit atau senyawa pengganggu
lainnya

Spesifik:
Mampu identifikasi respon untuk analit tunggal/
murni

60
Spesifisitas/Selektivitas:
Jika tersedia zat hasil degradasi:

Suntikkan:
Blanko sampel/Placebo (Sampel minus analit)
Zat Hasil degradasi (degradants)
Zat yang memiliki struktur mirip (Related
substances
Zat metabolit (untuk bioanalisis)

61
 Spesifisitas/Selektivitas:
Blanko sampel/Placebo
tidak menghasilkan
peak/noda dengan
waktu retensi/Rf yang
sama dengan analit

Peak/noda analit
terpisah dari
peak/noda lainnya
(Rs 1,5)

62
Placebo

Sampel

(Rs 1,5)

63
 Specificity/Selectivity:

Jika tidak tersedia zat hasil degradasi (Degradants)

Lakukan forced degradation studies (studi

degradasi paksa)

Sampel disimpan pada suhu/kelembaban

tertentu atau penambahan oksidator

Bandingkan profil pemisahan peak sebelum

dan sesudah perlakuan
64
Forced Degradation Studies

Heat Temperature (50 - 60 oC)

Humidity Kelembaban (70 to 80%)
Acid Hydrolysis HCl 0.1 N
Base Hydrolysis NaOH 0.1 N
Oxidation H2O2 (3 to 30%)
Light UV/Vis

65
 Spesifisitas: Uji kemurnian analit

Menggunakan Detektor Diode array

Teknik Spiking
Peak hasil spiking menunjukkan satu
peak/noda dan memiliki tR/Rf sama
Pada TLC
menggunakan sistem pengembang berbeda-beda
GC-MS
LC-MS; LC-MS/MS

66
Contoh studi degradasi paksa (HPLC-
DAD)

PENETAPAN KADAR
PAROXETINE
DALAM SEDIAAN
TABLET

67
Overlay spectra UV - analit

68
Hasil Degradasi terhadap tablet paroxetine
20 mg
* RRT, relative retention time.

Condition Time % Recovery RRT* of degradation

(h) products
Acid 0.1 N HC1, 80C 50 98.0 None detected
Base 0.1 , 80C 50 96.5 1.65
Hydrogen peroxide 0.3%, 80C 2 73.0 0.19, 0.22, 0.23, 0.27
0.31, 0.35, 0.39, 0.43
0.45, 0.49, 0.52, 0.55
0.59, 0.63, 0.71, 0.76
1.13, 1.36, 1.64
Heat dry, 80C 72 99.2 None detected
Heat wet, 80C 72 96.2 1.65
Light dry, 1000 foot candles 144 99.5 None detected
Light wet, 1000 foot candles 144 80.3 0.17, 0.20, 0.23, 0.42
0.44, 0.55, 0.82, 0.88
1.13, 1.60

69
Uji spesifisitas metode dengan PDA

Detektor PDA (Photodiodearray) atau disebut

juga diode array detector (DAD)
Dapat menampilkan spektra UV/Vis dari
puncak yang terelusi
Mampu melakukan identifikasi puncak
Dapat mengenali panjang gelombang
maksimum, peak matching (menghitung
match factor atau MF), library search dan
evaluasi kemurnian peak (peak purity)
Dapat menampilkan 3-D spektra

70
Spektra 3D
HPLC-DAD

Spektra UV/Vis analit dan baku

pembanding overlay
Evaluasi korelasinya (r, MF)

Kemurnian puncak 200 250 300 350 400 nm

Pengukuran spektra pada upslope,

apex dan down slope
dapat diketahui Peak pure atau impure
Match Factor (MF) dan Similarity (r)

MF = 1000 r = 1 100% pure peak

MF > 990 r > 0.99 pure
MF < 900 r < 0,99 impure
900 < MF < 950 0,90 < r < 0,95
contaminated
Pure and Impure HPLC peaks

74
 Linieritas (Linearity)

Kemampuan suatu metode

untuk menunjukkan
hubungan secara langsung
atau proporsional antara
respons detektor dengan

Respon alat
perubahan konsentrasi

analit.

A B C D

75
Linieritas

Melalui analisis statistik

Linear Regression (y = mx + b)
Correlation Coefficient (r),
y-intercept (b), slope (m), r
( xi x )( yi y )
{( xi x ) 2 ( y y ) 2 }1/ 2
residual sum of squares 1

Disarankan menggunakan minimum 5

macam konsentrasi analit
Disarankan terhadap sampel yang independen, bukan
dari sampel hasil pengenceran
Dapat digunakan larutan baku hasil pengenceran
dan/atau larutan spike
76
Evaluasi terhadap Linieritas

Relative process standard deviation (Vxo)

Mandel test
Residual test
ANOVA-linearity testing
RSD of the Plot of response factor Vs. concentration
Xp value- Funks et al.
r value
Homogeneity of the linear-curve

77
Evaluasi Linieritas
S xo
V XO 100%
X

S XO
S
Y where SY
y i
i
y
a bxi
, y
b N 2

Y Y
2
1
X P 2 S XO .ttable . 1 2P with
N b .Q XX
1 X2
YP a SY . ttable . 1
N Q XX

X
2
1
Q XX X i , t student t factor for f N - 2
2
i
N
and p 0.05

Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear

Vxo = <2-5%
Vxo = koefisien variansi regresi linear
78
Koefisien korelasi

Nilai r ternyata TIDAK menjamin

linieritas respons dan konsentrasi
Kurva non linier dapat memiliki r yang
tinggi
Korelasi linier jika rhitung > rtabel. Harga r
tergantung jumlah konsentrasi. Contoh n = 5
rtabel = 0,878; n = 10 r tabel = 0,632

r membuktikan linieritas jika rentang

tidak terlalu lebar dan r 0,999

79
Persamaan garis regresi

koefisien korelasi r 0,999

Persamaan garis melewati titik 0,0
Intersep tidak berbeda secara bermakna
dengan nol lakukan uji t
Slope berbeda secara bermakna dengan harga
nol lakukan uji t

80
Rentang (Range)

Interval antara konsentrasi terbesar

dan terkecil dari analit dalam sampel
Memenuhi syarat dalam hal presisi,
akurasi dan linieritas

81
Minimum Specified Range:

For Drug Substance & Drug product

Assay
80 to 120% of test Concentration
For Content Uniformity Assay
70 to 130% of test Concentration
For Dissolution Test Method
+/- 20% over entire Specification Range
For Impurity Assays
From Reporting Level to 120% of Impurity Specification for
Impurity Assays
82
Akurasi

Biasanya dinyatakan dalam persen

perolehan kembali (% recovery)
Dapat dilakukan melalui pebandingan
hasil analisis antara metode yang
divalidasi dengan metode standar uji
t harus tidak berbeda makna
Dapat dilakukan metode adisi standar
terhadap blanko atau sampel.

83
Akurasi

Persen perolehan kembali (% recovery)

Kadar yang diperoleh

% Re c x100 %
Kadar sesungguhn ya

Persyaratan untuk assay validation = 98-

102%

Dianjurkan menggunakan tiga macam

konsentrasi masing-masing 3 kali replikasi
Adisi standar pada blanko/plasebo

84
Analyte recovery at different concentration

Analyte Ingred. Analyte Mean recovery

Unit
(%) ratio (%)
100 1 100 % 98-102
10 10-1 10 % 98-102
1 10-2 1% 97-103
0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 60-115
0.0000001 10-9 1 ppb 40-120
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
85
Presisi
Kedekatan dari suatu seri pengukuran yang
diperoleh dari sampel yang homogen

Dalam bentuk RSD (relative standard deviation)

Meliputi:
- Repeatability
- Intermediate Precision
- Reproducibility
86
 Uji Presisi :

Dianjurkan menggunakan 3 macam

konsentrasi berbeda, misal 80, 100 dan 120
% dari konsentrasi target
Masing-masing konsentrasi dilakukan 3
replikasi
Dapat dilakukan pada satu konsentrasi
dengan 6 kali replikasi
Dianjurkan juga dilakukan pada hari yang
berbeda dan analisis yang berbeda
Kriteria penerimaan: tergantung kategori
analisis atau konsentrasi analit
Contoh: RSD < 2% (kategori I)
87
Analyte concentration vs precision

Analyte % Analyte ratio Unit RSD (%)

100 1 100 % 1.3
10 10-1 10 % 2.7
1 10-2 1% 2.8
0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30
AOAC manual for the Peer-Verified Methods program
88
Kurva Horwitz

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)

C adalah konsentrasi (fraksi desimal)

Misalnya : Untuk kadar C = 100%

maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

HORRAT = SBRobs/SBRcalc

89
 Batas Deteksi

Batas Deteksi:
Konsentrasi terendah analit dalam
sampel yang masih dapat
terdeteksi

90
Detection Quantitation Limit
Limit (DL) (QL)
Lowest amount of Lowest amount of
analyte in a sample analyte in a sample
that can be detected that can be quantified
but not necessarily with suitable accuracy
quantitated. and precision.
Estimated by Signal Estimated by Signal to
to Noise Ratio of 3:1. Noise Ratio of 10:1.

91
 Detection Limit (DL) and Quantitation Limit (QL)

1. Based in Visual Evaluations

- Used for non-instrumental methods

2. Based on Signal-to Noise-Ratio

- 3:1 for Detection Limit
- 10:1 for Quantitation Limit

3. Based on Standard Deviation of the Response

and the Slope
menggunakan sampel konsentrasi rendah
dapat digunakan SD dari residual;
92
SD intrersep
Based on Signal-to Noise-Ratio

93
Based on the Standard Deviation of the
Response and the Slope

where
s = the standard deviation of the
response ( SD of blank samples or SD of
intercepts of regression line)
S = the slope of the calibration curve

94
Robustness
Definition: Capacity to remain unaffected
by small variations in method parameters
Determination: Comparison results under
differing conditions with precision under
normal conditions
Variations may include: stability of analytical
solution, variation of pH in a mobile phase,
different column (lot/supplier), temperature, flow
rate.

95
Revalidasi

Revalidasi metode dilakukan jika ada

perubahan yang signifikan.
Untuk menjamin bahwa karakterisik metode
analisis (misal spesifisitas) tidak mengalami
perubahan.
Untuk menjamin validitas metode analisis
untuk uji identifikasi, penetapan kadar atau
kemurnian bahan atau produk obat.
Jenis parameter revalidasi tergantung tingkat
signifikansi perubahan Dibedakan
perubahan mayor dan minor (J. Ermer and
Miller).
96
Re-Validation

When sponsors make changes in the

analytical procedure, drug substance,
drug product, the changes, may
necessitate revalidation of the
analytical procedures.
The degree of revalidation depends on
the nature of the change.

97
Method Adjustment (Ch. 621 USP 39)
Parameter
1. pH Fase gerak
2. Konsentrasi garam pada Dapar
3. Komponen Fase gerak
Contoh: methanol-air =50:50
Metanol air = 98: 2
4. Temperatur kolom
5. Volume injeksi
Perubahan yang diperbolehkan
0.2
10%
Komponen minor (50%) : 30%
relative atau maksimum 10%
absolut
30% dari 50 = 15% (melebihi 10%
absolut) perubahan yang
diperbolehkan maksimum 10%
60: 40 atau 40:60
30% dari 2 = 0,6%
Boleh diubah dalam rentang
98,6:1,4 97,4:2.6
10%
Boleh diubah asal masih memenuhi
presisi, akurasi, linieritas dan batas
deteksi
Method Adjustment (Ch. 621 USP 39)
Parameter
6. Panjang gelombang detector UV
7. Kece alir fase gerak
8. Panjang kolom (L)
Pada elusi gradien
Perubahan yang diperbolehkan
Tidak boleh diubah
50% (isokratik)
- Tergantung ukuran partikel (dp)
- Boleh diubah asal L/dp tetap
atau antara -25% sampai +50%
- Boleh diubah asal Nilai lempeng
teoretis (N) tetap atau antara -
25% sampai +50% (Lihat tabel)
- Panjang kolom dan ukuran
partikel tidak boleh diubah
 Tabel perubahan panjang kolom dan ukuran
partikel yang diperbolehkan

Contoh:

Contoh kolom 150-mm 4.6-mm; 5-mm dengan kecepatan alir

1.5 mL/min akan menghasilkan pemisahan yang sama dengan
kolom 75-mm 2.1-mm; 2.5-mm dengan kecepatan alir 0.6
mL/min (Tekanan naik 4 kali lipat tetapi waktu analisis menurun
30%.

100
Perawatan Kolom HPLC

Kolom HPLC berperan sangat penting

dalam keberhasilan pengujian sampel
Kolom HPLC telah berkembang sangat
pesat sehingga saat ini dapat diperoleh
dari berbagai dimensi, jenis dan
kepolaran fase diam
Penanganan, perawatan dan
pemeliharaan kolom HPLC yang benar
dan konsisten akan memberikan kinerja
dan lifetime kolom HPLC yang maksimal
Perawatan kolom bervariasi tergantung
jenis kolom, metode HPLC dan sampel
yang dianalisis.
Kolom HPLC yang baik (ideal)

Menghasilkan:
Bentuk puncak yang simetris
Puncak yang ramping
Waktu retensi yang reprodusibel
Tekanan yang normal
Resolusi yang memenuhi kriteria
Baseline yang stabil.
Penyimpangan dari kondisi tersebut
(tailing, fronting, broadening,
splitting) dapat disebabkan oleh
kinerja kolom yang menurun.
Perawatan Kolom HPLC

Analis hendaknya memahami

dengan baik spesifikasi kolom yang
digunakan dalam pengujian
Sebelum penggunaan/instalasi
kolom pada instrumen HPLC,
sebaiknya Analis membaca terlebih
dahulu brosur/leaflet kolom yang
disertakan dalam kemasan aslinya.
Perawatan kolom

Semua kolom yang ada di laboratorium perlu

diberi label yang terkait langsung dengan
spesifikasi tertentu (Kolom RP atau NP)
Jika kolom RP-18 (L1 atau ODS), masih perlu
dibedakan lebih lanjut misalnya apakah:
RP-18 konvensional
RP-18 encapped (RP-18e)
RP-18 encapped dan high/ultra pure silica
Kolom yang tidak digunakan, sebaiknya
disimpan dalam kemasan aslinya disertai
dengan leaflet
Riwayat kolom HPLC

Sebaiknya masing-masing kolom HPLC

memiliki log book rekaman penggunaan
dan kinerjanya
Isi log book dapat berupa:
Jenis penggunaan
Jenis sampel yang digunakan
Berapa kali injeksi
Data theoretical plate (N)
Status: Ok atau tidak
Kolom yang digunakan untuk ion pairing
HPLC (oktan sulfonate atau Tetra butyl
ammonium) sehingga dedicated untuk
ion pairing
Gangguan pada kolom
Kolom colappse

Faktor Penyebab:
Serangan kimia
Penggunaan kolom HPLC di luar rentang pH stabilitasnya
Buntu pada frits atau kolom akibat partikel
dari sampel & fase gerak
Goncangan fisik akibat jatuh
Adsorbsi pengotor pada fase diam yang
berasal dari sampel (bahan alam)
Pengaruh pH pada kolom HPLC
Pengaruh pH pada kolom HPLC

Pengaruh Reagen ion pair pada

kolom
Pemeliharaan kolom RP-HPLC

Saring larutan sampel sebelum

disuntikkan
Buffer harus disaring dan cek terjadinya
presipitasi khususnya pada elusi gradient
Buffer dibuat segar
Cuci sistem sebelum dimatikan (sesuai
jenis dan petunjuk produsen)
Gunakan Pelarut fase gerak dengan
grade HPLC
Lakukan Degassing Fase gerak
Pencucian kolom

Pencucian kolom tergantung pada jenis

atau spesifikasi kolom
Cara pencucian kolom umumnya terdapat
pada leaflet kolom.
Secara umum, senaiknya lakukan
pencucian seperti yang dianjurkan oleh
produsen kolom (informasi pada leaflet)
Regenerasi kolom (Reversed phase)
 Terima Kasih

Mochammad Yuwono
Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya
E-mail: yuwono05@yahoo.com

112