MAKALAH

KALIBRASI DAN VALIDASI ALAT

(HPLC DAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS)

Disusun Oleh:

Haya Fathana
1908203010006

PROGRAM STUDI MAGISTER KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SYIAH KUALA
DARUSSALAM, BANDA ACEH
MEI 2020

i
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI ................................................................................................................ ii

KATA PENGANTAR .................................................................................................. iii

BAB I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ........................................................................................................ 1
2.2. Rumusan Masalah .................................................................................................... 1
2.3. Tujuan ...................................................................................................................... 2

BAB II. TINJAUAN KEPUSTAKAAN

2.1. Pengertian Kalibrasi dan Validasi Alat .................................................................... 3

2.2. Kalibrasi dan Validasi Pada High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ..... 4
2.2.1. Frekuensi Kalibrasi dan Validasi HPLC .......................................................... 5
2.2.2. Prosedur Kalibrasi HPLC ............................................................................... 7
2.2.3. Validasi Data HPLC ....................................................................................... 10
2.2.4. Resiko yang Terjadi Jika Tidak Dilakukannya Kalibrasi Pada HPLC .............. 12
2.3. Kalibrasi dan Validasi Pada Spektrofotometer UV-Vis ............................................. 12
2.3.1. Frekuensi Kalibrasi dan Validasi pada Spektrofotometer UV-Vis ................... 13
2.3.2. Prosedur Kalibrasi Spektrofotometer UV-Vis ................................................. 14
2.3.3. Validasi Data pada Spektrofotometer UV-Vis ................................................ 15
2.3.4. Resiko yang Terjadi Jika Tidak Dilakukannya Kalibrasi Pada
Spektrofotometer UV-Vis ............................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 17

ii
 KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah, segala puji hanya dipanjatkan kehadirat Allah SWT yang telah
memberikan bermacam-macam nikmat, terutama nikmat iman dan nikmat islam yang tidak
semua manusia mendapatkannya. Shalawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada
junjungan Nabi besar Muhammad SAW yang telah membawa kita dari zaman kebodohan ke
zaman yang penuh dengan ilmu, sehingga penulis dapat menyelesaikan Makalah Kalibrasi dan
Validasi Alat (HPLC dan Spektrofotometer UV-Vis, Pada mata kuliah Pengelolaan
Laboratorium. Mata kuliah ini merupakan salah satu matakuliah wajib pada magister kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa makalah ini jauh dari kata kesempurnaan karena
keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang telah dimiliki. Penulis mengharapkan adanya
kritik dan saran yang membangun dalam penyusunan makalah ini. Akhir kata penulis berharap
semoga makalah ini bermanfaat dan menambah wawasan bagi pembaca.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb

Banda Aceh, 1 Mei 2020

Penulis

iii
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Suatu data hasil analisis dapat memberikan jaminan kualitas apabila

didukung oleh tiga komponen penting yaitu: Metode yang valid, alat ukur yang
terkalibrasi dan analis yang kompeten pada pengujian. Jaminan kualitas data hasil
analisis merupakan bagian dari manajemen mutu yang difokuskan pada pemberian
keyakinan bahwa persyaratan mutu akan dipenuhi. Dalam ISO 17025 (2005) butir
5.5 di nyatakan bahwa alat uji yang menentukan hasil pengukuran harus dikalibrasi
(Irawan 2019). Melakukan kegiatan kalibrasi alat ukur dan alat pengujian serta
validasi metode analis merupakan salah satu persyaratan penting yang harus
dipenuhi untuk suatu laboratorium pengujian dan kalibrasi yang berdasarkan
standar Internasional ISO/IEC (Kenkel, 2014).

Berdasarkan penjelasan diatas, maka penulis akan menguraikan frekuensi

kalibrasi dan validasi alat, bagaimana cara kalibrasi dan validasi suatu alat dan
resiko jika kalibrasi dan validasi tidak dilakukan terhadap hasil analisis. Dalam
uraian tersebut, Penulis akan menjelaskan hal yang diuraiakan tersebut pada dua
instrument yang berada di Laboratorium Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala. Instrumen yang akan dibahas yaitu
HPLC dan Spektrofotometer UV-Vis. Kedua instrument tersebut sangat sering
digunakan untuk memperoleh data baik dalam praktikum maupun dalam suatu
penelitian. Sehingga penulis merasa kedua instrument tersebut sangat penting untuk
dipelajari.

1.2 Rumusan Masalah

1. Seberapa banyak frekuensi kalibrasi dan validasi terhadap suatu alat

pengujian
2. Bagaimana cara melakukan kalibrasi dan validasi suatu alat pengujian
3. Apa dampak yang ditimbulkan jika alat tidak dilakukan kalibrasi dan
validasi terlebih dahulu sebelum dilakukannya pengujian

1
1.3 Tujuan

Makalah ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada pembaca

bahwa pentingnya melakukan kalibrasi dan validasi alat sebelum melakukan suatu
pengujian, bagaimana cara melakukan kalibrasi dan validasi beberapa alat
pengujian serta bahaya apa yang akan ditimbulkan akibat tidak dilakukannya
kalibrasi dan validasi alat terlebih dahulu sebelum dilakukannya pengujian

2
 BAB II
TINJAUAN KEPUSTAKAAN

2.1 Pengertian Kalibrasi dan Validasi Alat

Kalibrasi merupakan suatu proses verifikasi alat ukur dengan cara

membandingkan dengan alat ukur standar referensi yang tertelusur ke standar
nasional. Tujuannya yaitu untuk mengetahui penyimpangan pada alat ukur,
menjamin hasil pengukuran dan mendukung system muti yang diterapkan.
Tertelusur diatas maksudnya adalah kemampuan dari hasil ukur secara individu
untuk dihubungkan ke standar nasional atau internasional untuk satuan ukuran atau
system pengukuran yang disahkan secara nasional maupun internasional melalui
suatu perbandingan.

Validasi terhadap suatu metode analisa juga menjadi faktor penting karena
hanya metode analisa yang telah dibuktikan validitasnya maka hasil pengukurannya
bisa dipertanggung jawabkan dan dipergunakan sebagai landasan dalam
perhitungan berikutnya (Sugihartini et al., 2014). Validasi merupakan suatu proses
dokumentasi atau pembuktian bahwa metode analisis menghasilkan data analitik
yang dapat diterima untuk tujuan penggunaannya adalah menentukan standar
minimum yang merupakan spesifikasi dari metode untuk tujuan yang ingin dicapai
(Christian, 2004). Parameter analitik yang diperlukan untuk validasi dapat
bervariasi bergantung pada tipe prosedur analitik seperti terlihat pada Tabel
dibawah ini:

3
 Kategori I merupakan metode analitik untuk kuantitasi komponen maupun
substansi bahan baku atau bahan aktif dalam suatu sampel. Kategori II meliputi
parameter metode analitik untuk menentukan campuran dalam substansi bahan
baku atau komponen sisa pada suatu sampel. Sedangkan kategori III adalah metode
analitik yang menetukan performa karakteristik. Proses validasi biasanya meliputi
pengujian parameter-parameter selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, sensitivitas,
rentang, limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ) (Harmita,
2004).

2.2 Kalibrasi dan Validasi Pada High Performance Liquid Chromatography

(HPLC)

Gambar 1. Instrumen HPLC yang berada di Laboratorium Kimia, Gedung B. Lt.

3.

Gambar diatas merupakan Instrumen HPLC yang berada di Laboratorium

Kimia Instrumen, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Syiah Kuala. Gambar tersebut penulis ambil pada tanggal 26 Februari 2020, ketika
penulis hendak menguji sampel penelitian serta menanyakan kondisi alat tersebut
kepada laboran yang bertanggung jawab dalam penggunaan alat tersebut. Kondisi
dari instrument HPLC yang berada dilantai 3 gedung B fakultas MIPA itu masih
sangat baru, artinya belum pernah digunakan dalam pengujian sampel penelitian,

4
hanya digunakan ketika pelaksanaan pelatihan para laboran yang bertanggung
jawab dalam melakukan operasi alat tersebut.

HPLC digunakan dalam pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.

Prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji
diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan
terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan
afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder
yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu Wadah Fase gerak yang digunakan
untuk menampung fasa gerak hingga 2 liter, Pompa yang digunakan untuk
mengalirkan fasa gerak, Injektor yang digunakan untuk menyuntikan sampel ke
fasa gerak yang mengalir menuju kolom, kolom dan fase diam yang digunakan
sebagai tempat berlangsungnya proses pemisahan solute/analit, detector digunakan
untuk mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.

2.2.1 Frekuensi Kalibrasi dan Validasi HPLC

HPLC merupakan alat instrumen yang harus dikalibrasi, hal ini dikarenakan
HPLC memiliki masa dimana akan menunjukkan hasil yang tidak optimal. Dan
kalibrasi perlu dilakukan supaya tidak didapatkan penyimpangan yang dapat
menimbulkan nilai koreksi pada alat. Berdasarkan persyaratan tambahan untuk
akreditasi laboratorium pengujian kimia dan biologi, jaminan mutu peralatan yang
digunakan dalam laboratorium pengujian kimia dan biologi yang dikeluarkan oleh
Komite Akreditasi Nasional (KAN) Januari 2004, memberikan rekomendasi
frekuensi normal dari kalibrasi atau pengecekan kinerja peralatan yang pada
umumnya digunakan dalam bidang pengujian kimia atau biologi. Frekuensi
kalibrasi yang direkomendasikan cukup memadai apabila kriteria berikut ini
dipenuhi. Adapun kriteria tersebut yaitu:

5
 1. Peralatan mempunyai kualitas yang baik dan kestabilan yang telah
dibuktikan dengan rekaman yang memdai
2. Laboratorium memiliki peralatan yang diperlukan dan staf yang kompeten
serta keahlian untuk melaksanakan pengecekan internal yang memadai
3. Apabila kriteria diatas tidak terpenuhi maka frekuensi kalibrasi harus lebih
sering

Frekuensi kalibrasi dan validasi pada HPLC juga sangat bergantug kepada
frekuensi penggunaan HPLC tersebut. Semakin sering alat tersebut digunakan
maka semakin sering pula dikalibrasi.

Berdasarkan hal tersebut, HPLC yang berada di Jurusan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala tidak terlalu
sering digunakan, karena intrumen ini merupakan instrument baru di Jurusan
Kimia. Sehingga kalibrasi dapat dilakukan 3 bulan sekali. Parameter penting dalam
kalibrasi HPLC yaitu kinerja system termasuk resolusi, sensitivitas, reproduktifitas,
waktu retensi dan tingkat kebisingan (SR-03 Komite Akreditasi Nasional).

6
2.2.2 Prosedur Kalibrasi HPLC

Kalibrasi merupakan pengecekan dan pengaturan akurasi dari alat ukur

dengan cara membandingkannya dengan standar/tolak ukur. Dalam makalah ini
penulis mengambil satu referensi bagaimana prosedur kalibrasi pada HPLC dari
Laboratorium Kalibrasi PT. Anugerah Sejahtera, Bogor, Jawa Barat. Dokumen
tersebut diterbitkan pada tanggal 26 April 2018. Berikut ini merupakan prosedur
kalibrasi HPLC

1. Kalibrasi pada Pompa HPLC

Tes Kebocoran pada 350 bar dengan methanol
• Lepaskan tubing pada outlet pump
• Tutup outlet pump dengan “Column end plug “
• Max Pressure limit sebesar 350 bar
• Set flow rate 0.2 ml /menit, jalankan pump
• pump akan berhenti secara otomatis bila tekanna telah mencapai 350
bar.
• Amati tekanan pada 1 menit setelah pump berhenti.
• Tekanan tidak bleh turun <310 bar.
• Buka reference valve untuk menghilangkan tekanan.
• bila pump gagal, amati apakah ada kebocoran pada setiap sambungan,
seal pluger dan lakukan perbaikan atau pergantian spare part bila
diperlukan, kebocoran ini.
Tes Akurasi Flow Rate Dengan Solvent Methanol
• Ganti “Column end plug “pada outlet pump dengan SS Tubing.
• Arahkan tubing ke dalam labu ukur 25 ml set flow rate pada pump A
sebanyak 5 ml / menit,
• dengan menggunakan stop watch catat waktu yang perlu diperlukan
untuk menampung 25 ml, lalu set flow rate 0 ml/menit.
• Arahkan tubing ke dalam labu ukur 10 ml, set flow rate pump A sebanyak
0,5 ml/menit
• dengan menggunakan stop watch, catat waktu yang perlu untuk

7
• Hitung akurasi flow rate dengan rumus = 1/3 {(A/300) + (B/600) +
(C/1200) } x 100 %, dimana :
• A = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 5 menit
• B = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 10 menit
• C = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 20 menit
• Akurasi flow rate harus <3%.
• Lakukan hal yang sama untuk pump B, C, dan D
Tes Akurasi Komposisi Gradient
• Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isis dengan methanol yang telah disring
dengan filter 0.4, masukan selang pump A ke dalam Erlenmeyer tersebut.
• Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isi dengan larutan propyl paraben dalam
methanol dengan konsentrasi 10 mg/ml, masukkan selang pump B ke
dalam Erlenmeyer tersebut.
• Lakukan priming untuk kedua solvent tersebut
• Sambungkan tubing outlet injector ke detector ( tanpa column dan pre
column ).
• Atur set up pump sebagai berikut
No Time Flow %A %B Curva
1 0.00 2.00 100 0 *
2 2.00 2.00 90 10 11
3 4.00 2.00 80 20 11
4 6.00 2.00 70 30 11
5 8.00 2.00 60 40 11
6 10.00 2.00 50 50 11
7 12.00 2.00 40 60 11
8 14.00 2.00 30 70 11
9 16.00 2.00 20 80 11
10 18.00 2.00 10 90 11
11 20.00 2.00 0 100 11
12 22.00 2.00 100 0 11
13 25.00 2.00 100 0 11
• Klik detector VWD
• klik set up VWD signal
• set Wave length = 257 nm
• Klik run control
• Klik sample info lalu isikan nama sampel dan nama file
• Lakukan injeksi methanol, tunggu hingga 25 menit

8
 • Setelah didapatkan kromatogram , lakukan integrasi dengan parameter
sebagai berikut
Minimum area 0
Minimum 0
height
Peak width Di set sehingga satu level diwakilinoleh satu
puncak (ada RT-nya)
Peak treshold Di set sehingga satu level diwakili oleh satu
puncak (ada RT-nya)
Pada integration event, lakukan force baseline by time mulai
0.0 menit -25 menit

• Cetak kromatogram dengan menggunakan reporting method yang ada

kolom peak height nya
• Masukkan nilai peak height tiap level yang menyatakan komposisi
vitamin B.
• Bagi peak height tiap peak dengan peak height dari peak yang mewakili
100% B.
• Kurangkan hasil pembagian tersebut dari 1/100 nilai %B yang
diwakilinya.
• Nilai maksimum dari hasil pada step sebelumnya adaah persentase
akiurasi komposisi.
• nilainya harus <0.5%.

2. Cek Keakurasian Suhu

• Ganti “column end plug” pada outlet pump dengan SS tubing.
• Set flow rate 2 ml /min. Set suhu 36˚C
• Arahkan tubing ke thermometer dan setelah suhu stabil, catat hasil yang
ditunjukkan thermometer.
• Selisih suhu maksimum 2˚C
3. Cek Detektor VWD
Tes Linearitas Absorbansi pada Detektor
• Siapkan standard caffeine dalam air dalam konsentrasi:
• 5 mg/L, 25 mg/L, 125 mg/L, 250 mg/L, dan beri label masing–
masing larutan #1 sampai #4.

9
 • set panjang gelombang = 272 nm.
• Pasang coloumn ODS STR-II 250 L x 4.0 mml. D, mobile phase
aquabidest 85% acetonenitrile 15%, flow rate 0.8 ml/min, suhu
column 36˚C
• Injekkan masing-masing standard dan print hasil kromatogramnya
• Hitung sensitifity dengan cara membagi pembacaan absorbens
• membagi pembacaan absorbens dengan konsentrasi larutan
masing-masing dan catat pada column sensitivity.
• Hitung % RSD dari coloumn sensitivity
• Hasilnya harus <5%
• Buat kurva yang menghubungkan konsentrasi dengan area
• Hitung nilai korelasinya nilai min adalah 0.99900
Stabilitas Temperatur, Tekanan dan Noise
• Pasang column ODS STR-II 250 L x 4.0 mml. D, mobile phase
aquabidest 100%, flow rate 1.0 ml/min , suhu column 36˚C
• Set panjang gelombang = 254 nm. Stop time 10 min.
• Run method tanpa menginajk apapun dan print hasil
kromatogramnya
• Amati nilai Wander dan drift pada kromatogram, nilai Wander
(mAU) maksimum 0.2 mAU dan nilai drift maksimum 0.5
mAU/h.
• Untuk temperature stability, nlai selisih temperature maksimum
adalah 0.5˚C
• Untuk temperature stability, nilai selisih temperature maksimum
0.5˚C
• Sedangkan untuk pressure stability, nilai selisih makimum 5%

2.2.3 Validasi Data HPLC

Parameter validasi pada HPLC yaitu Selektifitas, Linearitas, Akurasi dan
Presisi. Untuk Selektifitas ditentukan dengan menghitung resolusi dari
kromatogram yang dihasilkan oleh sampel isolate kloroform ekstrak daun
tembakau. Menurut Snyder dkk. (2010), syarat resolusi yang baik yaitu dimana

10
senyawa analit terpisah dari senyawa-senyawa yang lain adalah lebih besar dari 1,5.
Resolusi dihitung dengan rumus:

Linearitas ditentukan dengan nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari
AUC baku sampel yang diplotkan terhadap konsentrasi baku. Nilai r yang
dipersyaratkan adalah lebih besar dari 0,999. Sedangkan rentang diperoleh dari
konsentrasi terendah hingga tertinggi baku sampel yang memberikan akurasi,
presisi dan linearitas yang baik

Akurasi ditentukan dengan persen perolehan Kembali (recovery), yang

dapat dihitung dengan rumus:

Presisi dinyatakan dalam koefisien variasi (KV), yang dapat dihitung

dengan rumus:

11
Gambar 2. Hasil Kalibrasi HPLC di Laboratorium Instrumentasi Kimia, Jurusan
Kimia, FMIPA. Unsyiah.

2.2.4. Resiko yang Terjadi Jika Tidak Dilakukannya Kalibrasi Pada HPLC

Suatu instrument yang jarang dikalibrasi atau bahkan tidak pernah

dikalibrasi tentunya memiliki beberapa resiko yang berdampak fatal. Beberapa
resiko yang dapat terjadi apabila HPLC jarang dilakukan kalibrasi yaitu: Data
(kromatogram) yang dihasilkan tidak akurat dikarenakan terjadinya pergeseran
nilai ukur akibat pengaruh dari lingkungan dan penggunaan, pemisahan yang terjadi
pada kolom tidak sempurna, temperature dan tekanan tidak stabil, dan terjadinya
kebocoran pada pompa sehingga berpengaruh terhadap kerusakan pada alat.

2.3 Kalibrasi dan Validasi Pada Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometer UV-VIS adalah salah satu metode instrumen yang paling

sering diterapkan dalam analisis kimia untuk mendeteksi senyawa (padat/cair)
berdasarkan absorbansi foton. Agar sampel dapat menyerap foton pada daerah UV-
VIS (panjang gelombang foton 200 nm – 700 nm), biasanya sampel harus

12
diperlakukan atau derivatisasi, misalnya penambahan reagen dalam pembentukan
garam kompleks dan lain sebagainya. Unsur diidentifikasi melalui senyawa
kompleksnya.

Dalam ISO 17025 (2005) butir 5.5 di nyatakan bahwa alat uji yang
menentukan hasil pengukuran harus dikalibrasi. Spektrofotometer UV-VIS
merupakan alat utama maka harus di kalibrasi. Kalibrasi instrumen
Spektrofotometer meliputi: Akurasi Panjang Gelombang, Akurasi fotometri,
Resolution, Kebocoran sinar/Straylight, Base line Stability, base line flatnest, dan
akurasi detektor.

Pengukuran kalibrasi Spektrofotometer UV-VIS bertujuan untuk

mengetahui kinerja instrumen apakah masih sesuai dengan standar yang
dipersyaratkan apa tidak. Dengan mengetahui unjuk kinerja alat maka akan dapat
menjamin mutu hasil data pengukuran dalam kegiatan penelitian maupun pengujian
(Irawan 2019).

Gambar 3. Spektrofotometer UV-Vis yang ada di Laboratorium Kimia Fisika,

Jurusan Kimia, FMIPA Unsyiah.

2.3.1 Frekuensi Kalibrasi dan Validasi pada Spektrofotometer UV-Vis

Penggunaan Spektrofotometer UV-Vis dijurusan kimia sangat sering
dilakukan sehingga frekuensi kalibrasi dan validasi pada alat tersebut sangat
penting untuk diperhatikan. Penggunaan Spektrofotometer UV-Vis di jurusan

13
Kimia bukan hanya digunakan pada keperluan penelitian saja, melainkan juga
dalam praktikum kimia fisika, kimia anorganik dan instrumentasi kimia.

Berdasarkan dokumen yang dikeluarkan oleh Komite Akreditasi Nasional

(KAN) mengenai persyaratan tambahan untuk akreditasi laboratorium pengujian
kimia dan biologi pada jaminan mutu peralatan yang digunakan dalam laboratorium
pengujian kimia dan biologi. Kalibrasi dilakukan selama tiga bulan sekali.
Parameter prnting dalam pengecekan yaitu pada akurasi bilangan gelombang dan
reproduksibilitas.

2.3.2 Prosedur Kalibrasi Spektrofotometer UV-Vis

1. Dinyalakan Instrumen Spektofotometer UV-Vis sesuai sengan SOP, tunggu

selama 1 jam.

2. Pengukuran baseline flatness dari range panjang gelombang terendah sampai

yang tertinggi.

3. Pengukuran baseline stability dengan memilih panjang gelombang tertentu,

misalnya 700 nm selama 1 jam.

4. Pengukuran Akurasi Panjang gelombang dengan menggunakan Filter Holmium

oxide, pilih menu spectrum pada instrumen, set scan panjang gelombang 260 nm

14
 sampai dengan 650 nm. Jika memakai filter Holmium Oxide cair, set scan
panjang gelombang 240 nm sampai 645 nm. Perulangan 10 x scan

5. Pengukuran akurasi panjang gelombang dengan menggunakan filter Didymium,

set scan panjang gelombang 320 nm sampai dengan 880 nm. Perulangan 10 x
scan.

6. Pengukuran akurasi fotometri dengan larutan Kalium dikromat 0,006% dalam

larutan HClO4 0,001N, pilih menu Photometri pada instrumen, set panjang
gelombang 235 nm, 257 nm, 313 nm, 350 nm dengan blangko pelarut.
Pembacaan 10 x perulangan.

7. Pengukuran akurasi fotometri dengan larutan Kalium dikromat 0,06% dalam

larutan HClO4 0,001N, pilih menu Photometri pada instrumen, set panjang
gelombang 430 nm dengan blangko pelarut. Pembacaan 10 x perulangan.

8. Pengukuran sinar sesatan/straylight dengan menggunakan larutan NaI 10%, pilih

menu Photometri pada instrumen, set panjang gelombang 220 nm dengan
blangko pelarut. Pembacaan 10 x perulangan. Menggunakan larutan KCl 1,2%,
pilih menu Photometri pada instrumen, set panjang gelombang 198 nm dengan
blangko pelarut. Pembacaan 10 x perulangan.

9. Pengukuran daya pisah/resulotion dengan menggunakan larutan Toluen dalam

Heksan 0,02%, pilih menu Photometri pada instrumen, set panjang gelombang
268,7 nm dan 267,0 nm dengan blangko pelarut. Pembacaan 10 x perulangan.

10. Pengukuran Linieritas Detektor dengan menggunakan larutan seri standar

Phospat konsentrasi 0 ppm sampai dengan 32 ppm. Plih menu Photometri pada
instrumen, set panjang gelombang 430 nm dengan blangko pelarut. Pembacaan
10 x perulangan (Irawan, 2019).

2.3.3 Validasi Spektrofotometer UV-Vis

Validasi merupakan proses berkelanjutan dan dengan tegas dinyatakan

bahwa setiap modifikasi dari sistem analitik seperti laboratorium berbeda, peralatan
uji berbeda, penguji berbeda dan lain-lain, diharuskan melakukan validasi tersendiri
yang disesuaikan dengan jenis dan lingkup modifikasi. Berkaitan dengan

15
kekhususan validasi, maka validasi alat perlu dilakukan tersendiri.
Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer.
Kelebihan spektrofotometer adalah panjang gelombang dari sinar polikromatis
lebih terseleksi karena spektrofotometer dilengkapi dengan monokromator seperti
prisma, grating, atau celah optis (Khopkar, 2003).

Metode validasi yang akan dibahas dalam makalah ini diambil dari jurnal yang
berjudul “Validasi Spektrofotometer Uv-Vis Pada Analisis Formalin Di Poltekkes
Kemenkes Pontianak” (2019). Pengerjaan sampel dilakukan dengan urutan
pembuatan reagen dan larutan standar formalin, pembuatan larutan standar dengan
cara manual kemudian dilakukan pengukuran absorbansi formalin secara
spektrofotometer, penentuan panjang gelombang maksimum, pembuatan kurva
standar (linearitas), pemeriksaan kadar formalin dalam sampel (standar formalin).

Reagen yang diperlukan yaitu larutan asam Kromatofat 0.5% dengan larutan
standar Formalin 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 4 ppm, 3 ppm, 2 ppm, 1
ppm, dan 0 ppm. Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan cara larutan
standar formalin 10 ppm diukur dengan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang
gelombang mulai dari 490 nm sampai dengan 590 nm dengan rentang tiap 10 nm
yang dipersempit mengikuti nilai absorban. Panjang gelombang maksimum
merupakan nilai absorbansi yang paling tinggi. Pembuatan kurva standar dilakukan
dengan menggunakan deretan standar formalin 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 ppm
yang ditambah dengan pereaksi kemudian diukur nilai absorbansinya dengan
spektrofotometer UV-Vis kemudian dibuat kurva hubungan antara konsentrasi dan
absorbansi sehinggga dapat ditarik secara linier. Kadar formalin didapatkan dari
absorban dalam sampel yang dihubungkan dengan menggunakan kurva dan rumus
(absorban standar dibagi absorban sampel dikali kadar standar).

2.3.4 Resiko yang Terjadi Jika Tidak Dilakukannya Kalibrasi Pada

Spektrofotometer UV-Vis.

Beberapa resiko yang mungkin terjadi apabila spektrofotometer tidak

dilakukan kalibrasi yaitu terjadinya penyimpangan absorbansi yang melebihi 2 %,
jika hal itu terjadi maka akan berakibat pada keakurasian data yang dihasilkan dari
pengukuran menggunakan alat tersebut. Sehingga data yang diperoleh tidak valid.

16
 DAFTAR PUSTAKA

Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, John Wiley and Sons, Inc., Danvers,
pp.126
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,
Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-135.
Irawan A., 2019. Kalibrasi Spektrofotometer Sebagai Penjaminan Mutu Hasil
Pengukuran Dalam Kegiatan Penelitian Dan Pengujian. Indonesian Journal
of Laboratory. 1(2): 1-9
Kenkel John, 2014, Analytical Chemistry for Technicians, Fourth Ed. CRC Press,
New York.
Modul Kursus“Pengecekan Kalibrasi Antara dan Verifikasi Peralatan Dalam
Laboratorium Pengujian Sesuai Dengan SNI ISO/IEC 17025;2008”
RCChem Learning Centre Bandung 7-11 Nopember 2011.
Snyder, L., Kirkland, J., dan Dolan, J., 2010, Introduction to Modern Liquid
Chromatography, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp.
307.
Sugihartini N., Fudholi A., Pramono S. dan Sismindari. 2014. Validasi Metode
Analisa Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat Dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi. Pharmaҫiana, Vol. 4, No. 2, 2014: 111-115.
Laboratorium Kalibrasi, PT Anugerah Sejahtera, Bogor, Jawa Barat, PS-HPLC-01.

17