VALIDASI METODE PEMERIKSAAN MIKROBIOLOGI

Makalah
Disusun untuk memenuhi tugas kelompok mata kuliah Mikrobiologi Pangan
Disusun Oleh :
Kelompok 4
1. Aldina Salsabila (P17334119047)
2. Alya Nur Afifanhya H (P17334119049)
3. Anis Kholishotun Nisa (P17334119050)
4. Legiaputri L. Nurulhidayah (P17334119060)
5. Rindianti Nur Islami (P17334119075)
6. Rizkika Aprillia (P17334119077)
7. Salsabila Hidayani (P17334119078)
8. Salwa Nadia (P17334119081)
9. Shahilla Auliyya Nurilhasni (P17334119084)
10. Yanti Widiastuti (P17334119089)

Kelas : D3 – 2B

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
PROGRAM STUDI D-III TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
2020
 KATA PENGANTAR

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha
Penyayang. Puji serta syukur kami panjatkan kehadirat-Nya yang telah
melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan
makalah dengan judul “Validasi Metode Pemeriksaan Mikrobiologi” ini.
Tidak lupa kami sampaikan rasa terima kasih kepada Ibu Iis Kurniati, S.Pd.,
M.Kes. selaku dosen pengampu mata kuliah Mikrobiologi Pangan yang telah
memberikan banyak bimbingan dan masukan yang bermanfaat dalam proses
penyusunan makalah ini serta semua pihak yang telah ikut serta membantu dalam
penyusunan makalah ini.
Meskipun kami sudah mengumpulkan banyak referensi untuk menunjang
penyusunan makalah ini, namun kami menyadari bahwa di dalam makalah yang
telah kami susun ini masih terdapat banyak kesalahan serta kekurangan. Kami
juga mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak agar makalah ini bisa
menjadi lebih sempurna.

Cimahi, Desember 2020

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar............................................................................................. i

Daftar Isi....................................................................................................... ii

BAB I Pendahuluan...................................................................................... 3

1.1 Latar Belakang................................................................................. 3

1.2 Rumusan Masalah............................................................................ 4
1.3 Tujuan Penulisan.............................................................................. 4
1.4 Manfaat Penulisan............................................................................ 4

BAB II Pembahasan..................................................................................... 5

2.1 Validasi Metode Pemeriksaan Biologi. .......................................... 5

2.1.1 Definisi ................................................................................ 5
2.1.2 Tujuan................................................................................... 5
2.1.3 Jenis Validasi Metode.......................................................... 5
2.1.4 Pedoman Validasi Metode Pemeriksaan Mikrobiologi........ 6
2.1.5 Faktor yang Menjadi Pertimbangan Pemilihan Metode....... 6
2.2 Tahap Persiapan Validasi.................................................................... 6
2.3 Parameter Validasi Analisis Mikrobiologi.......................................... 10

BAB III Penutup........................................................................................... 14

3.1 Kesimpulan...................................................................................... 14
3.2 Penutup............................................................................................. 14

Daftar Pustaka.............................................................................................. 15

ii
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Validasi metoda pengujian adalah suatu proses pembuktian atau
konfirmasi pengujian yang obyektif di laboratorium, bahwa metoda yang
digunakan memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan
tujuan penggunaannya. Dalam melakukan validasi, aspek yang tidak boleh
diabaikan adalah aspek perencanaan. Ketika melakukan perencanaan, kita
harus mempertimbangkan biaya yang dibutuhkan untuk melaksanakan
validasi metode analisa. Besarnya biaya ini tentunya akan tergantung dari
kebutuhan penggunaan peralatan dan bahan habis pakai yang diperlukan.
Salah satu yang harus dipertimbangkan adalah banyaknya ulangan yang
dilakukan dalam melakukan validasi metode. Hal ini akan tergantung dari
metode rujukan yang digunakan untuk validasi metoda. Karena setiap metode
validasi memiliki persyaratanyang berbeda-beda. Sebagai contoh, untuk
metode validasi dari SacSinglas, dibutuhkan setidaknya 15 ulangan.
Banyaknya jumlah ulangan tergantung dari metode apa yang dipilih dalam
melakukan validasi metode.
Secara tahapan perbedaan validasi dan verifikasi metode dapat dilihat dari
banyaknya tahapan yang harus dilakukan. Tahapan validasi sebenarnya cukup
kompleks, sehingga dibutuhkan ketersediaan sumber daya dan waktu yang
cukup untuk pelaksanaan ini. Persiapan terkait biaya yang dibutuhkan tidak
sedikit, karena laboratorium harus menyediakan peralatan, media, reagen, dan
kultur media yang memadai. Tahapan validasi metode uji mikrobiologi
bergantung pada pemilihan metode validasi. Jika menggunakan standar
Sacsinglas, parameter validasinya yaitu presisi, akurasi, sensitivitas dan
spesivisitas, selektivitas, counting range, relative recovery, robustness, dan
analisa pathogen.
Dalam penerapannya laboratorium sering mengalami kendala, khususnya
pada validasi metode uji mikrobiologi diantaranya karena kendala waktu,

3
 4

metode yang digunakan, jumlah ulangan, biaya, sensitivitas, selektivitas,

recovery, dan beberapa parameter lain yang telah ditentukan serta
kompleksitas pengujian mikrobiologi. Oleh karena itu validasi metode
mikrobiologi sering dianggap susah dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa saja yang perlu diketahui mengenai validasi ?
2. Bagaimana tahapan persiapan validasi ?
3. Apa saja yang termasuk jenis parameter validasi ?

1.3 Tujuan Penulisan

1. Untuk mengetahui hal umum mengenai validasi metode pemeriksaan
mikrobiologi
2. Untuk mengetahui dan memahami bagaimana tahapan persiapan validasi
3. Untuk mengetahui apa saja jenis parameter validasi

1.4 Manfaat Penulisan

1. Bagi penyusun
Dengan adanya makalah ini diharapkan penyusun dapat lebih memahami
mengenai validasi metode pemeriksaan mikrobiologi, bagaimana tahapan
persiapannya, serta jenis parameter validasi.
2. Bagi pembaca
Dengan adanya makalah ini diharapkan dapat menambah dan memperluas
wawasan pembaca mengenai validasi metode pemeriksaan mikrobiologi
serta dapat dijadikan sebagai panduan, pegangan, atau pedoman saat
melakukan praktek.
 BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Validasi Metode Pemeriksaan Mikrobiologi
2.1.1 Definisi
Validasi Metode Pemeriksaan adalah proses pembuktian atau
konfirmasi pengujian yang objektif di Laboratorium, dan bahwa
metode itu memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai
dengan tujuan penggunaannya.

2.1.2 Tujuan
 Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi,
presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan dan keterbatasan metode
 Menguji faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kinerja metode
dan mengetahui besarnya pengaruh itu terhadap hasil analisis
 Melakukan verifikasi atau membuktikan kinerja metode analisis
baku yang diadopsi/digunakan laboratorium

2.1.3 Syarat
 Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasi
 Dilaksanakan oleh pesonel yang kompeten
 Media/Reagent yang digunakan sesuai spesifikasinya
 Kondisi lingkungan memadai

2.1.4 Jenis Validasi Metode

 Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode
analisis “baru” hasil pengembangan, atau metode yang
dimodifikasi terhadap suatu metode standar.
 Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium
menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah
divalidasi.

5
5
 6

2.1.5 Pedoman Validasi Metode Pemeriksaan Mikrobiologi

 ISO 16140 – Microbiology of food & animal feeding stuffs –
Protocol for the validation of alternative methods
 The United States Pharmacopeia (USP) 27, 2004
 International Conference on Harmonization, 1996
 Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C
& B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July 2002.
 Feldsine, et.al., AOAC International method Committee
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food
Microbiological Official Method of Analysis, Journal of AOAC
International Vol. 85 No.5 2002.
 Water quality – Guidance on Validation of Microbiological
Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000.
 Procedure for The Estimation and Expression of Measurement
Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food
Analysis, NMKL, No.5, 1997.
 APHA Standard methods for the Examination of Water and
Wastewater, 20th ed., 1998.

2.1.6 Faktor yang Menjadi Pertimbangan Pemilihan Metode

 Asal metode
 Status metode
 Penguasaan laboratorium terhadap teknologinya
 Kompetensi sumber daya manusia/ analis
 Biaya dan waktu yang diperlukan
 Kemudahan pengaplikasian metode
 Ketersediaan akomodasi dan peralatan laboratorium yang
memadai.

2.2 Tahap Persiapan Validasi

 7

Tahap persiapan merupakan tahapan awal pada penelitian yang dilakukan

untuk mengetahui potensi adanya permasalahan. Tahap persiapan terdiri atas
tahap perencanaan dan persiapan sampel, persyaratan mikroorganisme dan
kontaminasi.

a. Perencanaan dan Persiapan Sampel

Perencanaan dalam validasi bertujuan untuk mengetahui dan
menyiapkan hal-hal yang diperlukan dalam melakukan validasi. Adapun
hal-hal yang harus disiapkan antara lain:

 Menggunakan peralatan yang sudah dikalibrasi

 Dilakukan oleh personil yang kompeten, yang mempunyai
pengalaman dan skill
 Media/reagent yang digunakan sesuai dengan spesifikasinya
 Sampel yang hendak digunakan telah tersedia dalam jumlah yang
sesuai dengan kebutuhan
 Program statistika untuk menghitung, mengevaluasi dan
menginterpretasikan hasil pengujian
Dalam melakukan validasi diperlukan sampel, sebelum
menggunakan sampel ada beberapa hal yang harus diperhatikan antara
lain:

 Nomor sampel dan kategori makanan yang diambil

Untuk kategori sampel makanan itu dibagi menjadi 2, yaitu:

 Makanan tanpa proses

Merupakan makanan yang dimakan dalam bentuk
aslinya, tanpa melalui proses pengolahan tertentu. Misalnya
buah-buahan, telur, susu dan sayur-sayuran.

 Makanan dengan proses

Merupakan makanan yang mengalami proses
pengolahan, sehingga bentuknya berbeda dengan bentuk
awalnya. Umumnya makanan yang diproses diberi minyak,
 8

garam, gula dan mengalami proses pemanasan, pasteurisasi,

pengeringan atau pengawetan. Contoh makanan yang
diproses adalah keripik singkong, jus dalam kemasan,
kentang yang dibekukan dan lainnya.

 Adanya kontaminasi secara alami atau tidak

 Inokulasi sampel
Yang terdiri atas kondisi saat pengkulturan, level inokulasi dan
flora kompetitif.

Untuk jenis makanan yang bisa diambil untuk sampel bisa

berasal dari daging, makanan laut, buah-buahan, sayur-sayuran,
coklat, kue-kue, pasta, mie, makanan hewan dan lainnya.

b. Persyaratan Mikroorganisme
Hal-hal yang harus diperhatikan antara lain:

1) Biasanya isolat, strain, serotipe atau spesies yang digunakan untuk

setiap jenis inokulasi dari produk makanan berbeda-beda, inokulasi
harus dilakukan dengan kultur murni dari satu strain. Inokulasi
campuran tidak dianjurkan.
2) Mikroorganisme yang berasal dari makanan dengan proses biasanya
stres sedangkan mikroorganisme yang mengkontaminasi juga
ditekankan dalam makanan ini. Mikroorganisme menjadi stres bisa
terjadi pada saat inokulasi ataupun pada saat proses pengolahan
makanan.
3) Makanan mentah yang tanpa proses dapat diinokulasi dengan
organisme tanpa tekanan. Inokulasi lyophilized umumnya digunakan
untuk makanan bubuk/butiran kering dan inokula basah digunakan
untuk makanan basah. Inokulasi sampel jenis makanan padat jika
disimpan dalam kondisi penyimpanan sesuai bisa membuat kondisi
sampel tetap stabil untuk dianalisis.
Jumlah mikroba dalam inokulum dan kontrol, yaitu:
 9

 Setiap jenis sampel makanan minimal dibagi menjadi 2 bagian. Satu

bagian sebagai kontrol negatif dan satu bagian lagi diinokulasi pada
tingkat yang menghasilkan pemulihan fraksional.
 Sampel uji kontrol dan yang diinokulasi harus disiapkan pada waktu
yang sama. Mungkin disarankan untuk menyiapkan bagian ketiga
yang memiliki tingkat inokulum tinggi.
c. Kontaminasi
Atau pencemaran adalah masuk atau dimasukkannya makhluk
hidup, zat, energi dan/atau komponen lain ke dalam sampel.

Adapun hal yang harus dilakukan jika sampel uji terkontaminasi

secara alami, yaitu:

1) Diperlukan 2 bagian dari setiap jenis makanan yang terkontaminasi

secara alami. Namun, produk yang terkontaminasi secara alami
jarang tersedia, perlu dilakukan upaya yang besar untuk
mendapatkannya karena mereka paling mewakili untuk selanjutnya
menentukan metode yang digunakan.
2) Menghasilkan data inklusif dan eksklusif untuk membuktikan bahwa
metode tersebut reaktif untuk serotipe utama dari mikroorganisme
tertentu dan non-reaktif terhadap mikroorganisme atau spesies
lainnya.
3) Pilih setidaknya 50 strain murni dari mikroorganisme spesifik dan
pilih sekurangnya 30 strain yang berpotensi kompetitif untuk
dianalisis sebagai sediaan kultur murni.
4) Untuk metode Salmonella, jumlah tekanan analit target ditingkatkan
menjadi 100 strain yang dipilih untuk mewakili sebagian besar
serotipe Salmonella yang diketahui.
Kontrol untuk pengujian kontaminasi dilakukan dengan cara, yaitu:

1. Sampel uji yang diinokulasi dan kontrol yang diinokulasi disiapkan

pada waktu yang sama. Jika ada bagian test kontrol yang tidak
diinokulasi maka positif untuk mikroorganisme yang diinokulasi,
 10

hasilnya menjadi tidak valid dan harus dilakukan pengulangan

karena diasumsikan telah terjadi kontaminasi silang.
2. Sampel kontrol tidak termasuk dalam jenis makanan yang
terkontaminasi secara alami.
2.3 Parameter Validasi Analisis Mikrobiologi
Parameter adalah karakteristik populasi (menggambarkan populasi). Dalam
desain penelitian, orang sering tertarik dalam mengestimasi parameter tertentu
dari populasi tertentu atau menguji hipotesis mereka. Adapun Parameter
Validasi analisis mikrobiologi yaitu :
1. Akurasi atau Kecermatan
Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai
actual atau nilai sebenarnya dari mikroorganisme target dalam sampel.
Akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian
dengan hasil yang sebenarnya.
Parameter :
Recovery (Perolehan kembali)
Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada
konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh. Peritungan :
H x 100%
A

H = Hasil Pengujian dengan metode (sample + spike) – sample

A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike)
Syarat > 70%
Catatan : Gunakan sample yang tidak megandung MO
2. Presisi atau Keseksamaan
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan
hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan
kondisi pengujian yang sama. Keterulangan ( Repeatability ), ketertiruan
(reproducibility ), keseksamaan antara (intermediate precision).

RSD = √ ∑ ¿ ¿ ¿ ¿
CV (Coefisien of Variation) = RSD x 100%
Syarat :
RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02)
CV = max.10%

3. Sensitivitas (Kepekaan)
 11

Sensitifitas (Kepekaan) yaitu Kemampuan metode untuk

mendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalam jumlah sekecil
mungkin atau kemampuan metode untuk mendeteksi/mengukur
mikroorganisme tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya
mikroorganisme asing atau bahan/matriks lain.
4. Selektivitas dan Spesifisitas
Selektifitas adalah kemampuan metode analisis untuk membedakan analat
yang akan ditetapkan terhadap senyawaan lain yang terdapat dalam sampel
(Wood et al, 1998). Selektifitas atau spesifitas suatu metode menyatakan
kemampuan penetapan secara akurat dan khusus dari komponen lain yang
dicurigai dapat mengganggu kondisi pengujian.
5. Linearitas
Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa
larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon
analit yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung ataupun
melalui transformasi matematika.
Cara pengujiannya yaitu Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3 kali
dengan konsentrasi antara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk
penentuan kadar dalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan
120% konsentrasi target
6. Rentang Hitung yang diterima ( acceptable )
Yaitu batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan
7. Robustness (Ketangguhan)
Pengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukan pada saat fase
pengembangan metode dan tergantung pada faktor-faktor yang
berpengaruh pada pengujian. Jika pengujian sangat peka terhadap
perubahan dalam kondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknya
dikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati- hatian.

Jenis keragaman kondisi pengujian yang harus diperhatikan :

a) Stabilitas sampel
b) Pengaruh suhu inkubasi
c) Pengaruh waktu inkubasi
d) Kondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujian mikroba tertentu)
e) Pengaruh jenis media (nutrisi) dan sebagainya

Terdapat 2 Metode Analisis Mikrobiologi Pangan :

1. Metode kualitatif
Metode analisis yang responsnya adalah ada atau tidaknya
anilit/mikroba yang terdeteksi baik secara langsung maupun tidak
langsung. Uji langsung terhadap mikroba indicator atau metode kultur
 12

untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Metode alternatif

( Dye-reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination).
Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya (metode
imunokimia, metode biologi molekuler).
2. Metode kuantitatif
Metode analisis yang responsnya adalah jumlah analit yang diukur
baik secara langsung (misalnya pencacahan dalam massa atau
volume), atau secara tidak langsung (misalnya penyerapan warna,
impedansi, dll.) dalam jumlah sampel tertentu. Untuk metode
kuantitatif, indikator parameter termasuk tes kualitatif dan
pengulangan, reproduksi dan penyimpangan standar relatif. Untuk
metode kuantitatif dapat dilakukan pengujian :
a) Angka Lempeng Total ( Total Plate Count )
b) MPN (Most Probable Number)
c) Uji potensi antibiotik
d) Uji sterilitas
e) Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)
f) Uji efektivitas pengawet

Prosedur Validasi dan Verifikasi :

a. Kuantitatif ( Hitungan Cawan)
1. Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali
2. Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode
spike sample) atau tidak mengandung organisme target
3. Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan semua
populasi
b. Kuantitatif MPN (Most Probable Number)
Kriteria :
a. Sensitifity
b. Specificity
c. False positive rate
d. False negatife rate
e. Efficiency
f. Confidence limit : 95%
Prosedur :
1. Siapkan sample (kontaminasi alami atau sengaja) sesuai prosedur.
2. Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-tabung
pertumbuhan
3. Hitung jumlah tabung yang positif dan negative
4. Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang terdapat
pada cawan atau setiap tabung yang positif dan negative
 13

5. Hitung sensitifitas, spesifisitas, positif palsu, negative palsu dan

efisiensi.

c. Kualitatif
1. Lakukan pengujian sedikinya 10 kali
2. Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode
spike sample) atau tidak menggunakan organisme target
3. Hitung sensitifitas, spesifisitas, positif palsu, negative palsu dan
efisiensi.
 BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Dalam metode pemeriksaan mikrobiologi, validasi merupakan hal yang

sangat penting karena validasi merupakan proses pembuktian atau konfirmasi
pengujian yang objektif di Laboratorium, dan bahwa metode itu memenuhi
persyaratan yang telah ditentukan, sesuai dengan tujuan penggunaannya. Maka
validasi merupakan salah satu penentu apakah pemeriksaan yang dilakukan di
Laboratorium memenuhi persyaratan atau tidak jika tidak maka pemeriksaan tidak
sesuai. Tentunya validasi tersebut tidak sekedar validasi asal – asalan tetapi diikuti
oleh pedoman, tujuan, dan syarat yang jelas.
Validasi dilakukan oleh personel yang kompeten dengan melalui beberapa
tahap yaitu, tahap perencanaan dan persiapan sampel, persyarataan
mikroorganisme, dan kontaminasi. Dari ketiga tahap tersebut tidak boleh ada
tahap yang terlewatkan karena kembali lagi ini merupakan proses validasi. Layak
atau tidaknya, sesuai atau tidaknya pemeriksaan mikrobiologi ditentukan oleh
proses validasi.

3.2 Saran

Setelah mempelajari tentang validasi metode pemeriksaan mikrobiologi ini

kiranya kita semua dapat memanfaatkan semaksimal mungkin materi ini sehingga
kita dapat mengerti tentang mikrobiologi, kami sadar dan mengetahui bahwa
makalah ini masih sangat jauh dari kata sempurna. Kami berharap adanya kritik
dan saran yang membangun dari pembaca unutk tersusunnya makalah yang lebih
baik lagi.

14
 15

DAFTAR PUSTAKA
M,Brio. 2015. Validasi dan Verifikasi Metode Mikrobiologi.
https://docplayer.info/49571023-Validasi-verifikasi-metoda-
mikrobiologi.html. Diakses pada tanggal 05 Desember 2020.
Marlia, Singgih. 2017. Validasi Metode Analisis Mikrobiologi Food.
https://www.google.com/amp/s/fdocuments.in/amp/document/validasi-
metode-analisis-mikrobiologi-foodpdf.html. Diakses pada tanggal 05
Desember 2020.
Slamet, Ibrahim. 2016. Validasi Metode Analisis Mikrobiologi.
https://fdokumen.com/document/validasi-metode-analisis-mikrobiologi-
revpdf.html. Diakses pada tanggal 05 Desember 2020.
Vannie, Lullaby. 2017. Validasi Metode Analisis Mikrobiologi.
https://www.scribd.com/doc/49570392/Validasi-Metode-Analisis-
Mikrobiologi. Diakses pada tanggal 05 Desember 2020.