MAKALAH KROMATOGRAFI

“Validasi Metode Analisis”

Kelompok 6:

Afrida Fajri (F202002007)

Aprizal Ridal Brian Pratama (F202001175)
Astri maya sari (F201901136)
Meliawati (F202002003)
Nur Norma Fazilah Vivian (F202002002)
Risye Octavina Rokot (F202002006)
Sufiati. M (F202002004)
Zakrawan Ananda Putra P. (F202002005)

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

PROGRAM STUDI S-1 FARMASI

UNIVERSITAS MANDALA WALUYA

KENDARI

2021

i
 Kata Pengantar

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa. Atas rahmat dan hidayah-
Nya, penulis dapat menyelesaikan tugas makalah yang berjudul "Validasi Metode
Analisis" dengan tepat waktu.
Makalah disusun untuk memenuhi tugas Mata Kuliah Kromatografi.
Selain itu, makalah ini bertujuan untuk mengetahui Validasi Metode Analisis
Beserta Kuliafikasi dan Proses Validasinya. Kami mengucapkan terima kasih
kepada Ibu apt. Himaniarwati, S.Si., M.Sc selaku dosen mata kuliah
Kromatografi. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada semua pihak yang
telah membantu menyelesaikannya makalah ini.
Kami menyadari makalah ini masih jauh dari sempurna. Oleh sebab itu,
saran dan kritik yang membangun diharapkan demi kesempurnaan makalah ini.

Kendari, 6 Agustus 2021

Penulis

ii
 Daftar Pustaka

Halaman

Sampul.....................................................................................................................i

Kata Pengantar.........................................................................................................ii

Daftar Pustaka.........................................................................................................iii

BAB I.......................................................................................................................1

A. Latar Belakang.............................................................................................1

B. Rumusan Masalah........................................................................................2

C. Tujuan..........................................................................................................2

BAB II......................................................................................................................3

A. Proses Validasi.............................................................................................3

B. Kualifikasi....................................................................................................4

C. Validasi Metode Analisis.............................................................................6

1. Akurasi / Accuracy................................................................................8

2. Presisi /Precision...................................................................................9

3. Spesifisitas...........................................................................................10

4. Batas Deteksi / Limit Of Detection (LOD).........................................11

5. Batas Kuantifikasi (Limit Of Quantitation) / LOQ.............................12

6. Linearitas.............................................................................................14

7. Kisaran (Range)..................................................................................14

8. Kekasaran (Ruggedness).....................................................................15

9. Ketahanan (Robustness) /Ketegaran...................................................15

10. Kesesuaian Sistem...............................................................................16

D. Elemen-Elemen Data Yang Dibutuhkan Untuk Uji Validasi.....................19

iii
BAB III..................................................................................................................21

A. Kesimpulan................................................................................................21

B. Saran...........................................................................................................22

Daftar Pustaka........................................................................................................23

iv
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode-metode analisis secara rutin dikembangkan, divalidasi,

dikaji secara bersama-sama dan diaplikasikan. Komplikasi metode-metode
analisis muncul di sejumlah kompedia seperti Farmakope Indonesia, USP
(United States Pharcopeia), AOAC (Association of Official Analitycal
Chemist), dan sebagainya.
Istilah Validasi pertama kali dicetuskan oleh Dr. Bernard T.
Loftus, Direktur Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat pada
akhir tahun 1970-an, sebagai bagian penting dari upaya untuk meningkatkan
mutu produk industri farmasi.Hal ini dilatar belakangi adanya berbagai
masalah mutu yang timbul pada saat itu yang mana masalah-masalah tersebut
tidak terdeteksi dari pengujian rutin yang dilaksanakan oleh industri farmasi
yang bersangkutan.Selanjutnya, Validasi juga diadopsi oleh negara-negara
yang tergabung dalam the Pharmaceutical Inspection Co-operation/
Scheme (PIC/S), Uni Eropa (EU) dan World Health Organization (WHO).
Bahkan, Validasi merupakan aspek kritis (substantial aspect) dalam penilaian
kualitas industri farmasi yang bersangkutan.
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.
Validasi metode analisis bertujuan untuk mengkonfirmasi bahwa metode
analisis tersebut dapat sesuai untuk peruntukannya (Gandjar, 2007). Validasi
metode anlisis juga merupakan proses yang dilakukan melalui percobaan
laboratorium dimana karakteristik dari suatu prosedur memenuhi persyaratan
untuk aplikasi analisis (USP XXXVII, 2014).

1
 Validasi metode merupakan proses utnuk memastikan bahwa prosedur
yang memnuhi standar reliabilitas, akurasi, preisis sesuai tujuan yang
diharapkan (Ahuja dan Dong, 2005). Validasi metode dilakukan untuk
menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2014).
Menurut Harmita pada Tahun 2004, validasi metode analisis adalah suatu
tindakan parameter tertentu, bersasarkan percobaan laboratorium untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam
penggunaannya.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah dalam makalah ini yaitu bagaimana cara melakukan

validasi metode analisis utnuk memastikan bahwa prosedur yang memenuhi
standar reliabilitas, akurasi, preisis sesuai tujuan yang diharapkan.

C. Tujuan

Adapun tujuan dari makalah ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui proses validasi.
2. Untuk mengetahui kualifikasi metode validasi.
3. Untuk mengetahui metode analisis.
4. Untuk mengetahui Elemen-Elemen Data Yang Dibutuhkan Untuk Uji
Validasi.

2
 BAB II

PEMBAHASAN

A. Proses Validasi

Proses validasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak 4
langkah nyata yaitu (Gholib, Ibnu. 2008):
1. Validasi perangkat lunak (Software validation)
2. Validasi perangkat keras / instrument (instrumen/hardware falidation)
3. Validasi metode
4. Kesesuaian system (system suitability)

Proses validasi dimulai dengan perangkat lunak yang tervalidasi dan

system yang terjamin, lalu metode yang divalidasi menggunakan system yang
terjamin dikembangkan. Akhirnya validasi total diperoleh dengan melakukan
kesesuaian system. Masing-masing tahap dalam proses validasi ini
merupakan suatu proses yang secara keseluruhan bertujuan untuk mencapai
kesuksesan validasi (Gholib, Ibnu. 2008).
Ada beberapa alasan valid untuk mengembangkan suatu metode
analisis baru, yaitu (Gholib, Ibnu. 2008):
1. Tidak ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam matriks sampel
tertentu.
2. Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode
yang sudah atau tidak reliabel (presisi dan akurasinya rendah).
3. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu banyak,
membutuhkan banyak energi, atau tidak dapat diotomatisasikan.
4. Metode yang telah ada tidak memberikan sensivitas atau spesifitas yang
mencukupi pada sampel yang dituju.
5. Instrumentasi dan tehnik yang lebih baru memberikan kesempatan untuk
meningkatkan kinerja metode tersebut, yang meliputi peningkatan

3
 identifikasi analit, peningkatan batas deteksi, serta akurasi dan presisi
yang lebih baik.
6. Ada suatu kebutuhan untuk mengembangkan metode alternatif baik
untuk alasan legal atau alasan saintifik.

Tata cara atau metode pembuktian tersebut harus dengan “cara yang
sesuai”, artinya proses pembuktian tersebut ada tata cara atau metodenya.
“Obyek” pembuktian adalah tiap-tiap bahan, proses, prosedur,
kegiatan, sistem, perlengkapan atau mekanisme yang digunakan dalam
produksi dan pengawasan mutu (ruang lingkup).
Sasaran/target dari pelaksanaan validasi ini adalah bahwa seluruh
obyek pengujian tersebut akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan
secara terus menerus (konsisten).

B. Kualifikasi

Setiap industri farmasi wajib mengidentifikasi validasi yang perlu

dilakukan sebagai bukti dari pengendalian aspek kritis dari kegiatan yang
dilakukan. Validasi dilakukan apabila terjadi perubahan yang signifikan
terhadap fasilitas, peralatan dan proses yang dapat mempengaruhi mutu
produk. Seluruh kegiatan validasi sebaiknya direncanakan dengan rinci, jelas
dan didokumentasikan dalam Rencana Induk Validasi (RIV) atau dokumen
sementara.
Sebelum melakukan validasi, terlebih dahulu harus membuat protokol
validasi yang dikaji dan disetujui oleh kepala bagian QA. Protokol validasi
dibuat dengan merinci langkah kritis dan kriteria penerimaan. Laporan
validasi mengacu pada protokol kualifikasi/validasi yang memuat ringkasan
hasil yang diperoleh, tanggapan terhadap penyimpangan yang terjadi,
kesimpulan dan rekomendasi perbaikan. Setiap terjadi perubahan harus
didokumentasikan dengan pertimbangan yang sesuai.
Validasi dilakukan setelah proses kualifikasi selesai dilakukan.
Kualifikasi dibagi menjadi empat tahapan, yaitu: (BPOM, 2018)

4
1. Kualifikasi Desain (KD)
Kualifikasi desain merupakan unsur pertama dalam melakukan
validasi terhadap fasilitas, sistem atau peralatan baru. Desain hendaklah
didokumentasikan dan memenuhi ketentuan CPOB.

2. Kualifikasi Instalasi (KI)

Kualifikasi Instalasi (KI) hendaklah dilakukan terhadap terhadap
fasilitas, sistem dan peralatan baru atau yang dimodifikasi. KI
dilaksanakan pada yang mencakup instalasi peralatan, pipa dan sarana
penunjang dan instrumentasi yang sesuai dengan spesifikasi dan gambar
teknik yang didesain, pengumpulan dan penyusunan dokumen
pengoperasian dan perawatan peralatan dari pemasok, ketentuan dan
persyaratan kalibrasi serta verifikasi bahan konstruksi.

3. Kualifikasi Operasional (KO)

Kualifikasi Operasional (KO) hendaklah dilakukan setelah KI
selesai dilaksanakan, dikaji dan disetejui. KO mencakup pengujian yang
pengujian yang perlu dilakukan berdasarkan pengetahuan tentang proses,
sistem dan peralatan serta mencakup pengujian yang terdiri dari 1 atau
beberapa kondisi batas operasional atas dan bawah atau yang sering
disebut dengan kondisi terburuk.

4. Kualifikasi Kinerja (KK)

KK dilakukan setelah KI dan KO selesai dilaksanakan, dikaji dan
disetujui. KK mencakup penggunaan bahan baku atau bahan pengganti
yang memenuhi spesifikasi atau produk simulasi yang dilakukan
berdasarkan pengetahuan tentang proses, fasilitas, sistem dan peralatan.
KK juga mencakup uji yang meliputi 1 atau beberapa kondisi terburuk
serta tahap kalibrasi, prosedur pengoperasian, pembersihan, perawatan

5
 preventif serta prosedur dan catatan pelatihan operator yang harus
didokumentasikan.

C. Validasi Metode Analisis

Validasi metode merupakan suatu proses (percobaan laboratorium)

untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode analisis telah
memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan sebelumnya. Sedangkan
verifikasi metode adalah suatu proses (percobaan laboratorium) untuk
membuktikan bahwa laboratorium mampu menggunakan metode analisis
baku/standar pada kondisi nyata di laboratoriumnya.
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.
Validasi metode analisis bertujuan untuk mengkonfirmasi bahwa metode
analisis tersebut dapat sesuai untuk peruntukannya (Gandjar, 2007). Validasi
metode
merupakan proses utnuk memastikan bahwa prosedur yang memnuhi standar
reliabilitas, akurasi, preisis sesuai tujuan yang diharapkan (Ahuja dan Dong,
2005). Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis
akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan
dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2014).
Validasi metode analisis dilakukan idealnya pada semua metode
analisis yang digunakan untuk pemeriksaan. Metode analisis ini diaplikasikan
baik pada metode analisis untuk produk jadi, bahan baku dan produk antara.
Metode analisis ini juga diaplikasikan pada pemeriksaan mikrobiologi.
Sebagai tambahan, validasi memastikan bahwa suatu prosedur tertulis
memiliki detail yang cukup jelas sehingga dapat dilaksanakan oleh analis atau
laboratorium yang berbeda dengan hasil yang sebanding. Alasan metode
harus divalidasi (diverifikasi):
• Untuk mengetahui tingkat akurasi dan presisi dari suatu data hasil
pengujian

6
• Tuntutan dari Pasar Internasional akan kualitas yang baik dari produk yang
diproduksi/ diperdagangkan
• Kualitas yang baik dapat diketahui dari data hasil analisis yang absah
(andal) terhadap komponen-komponen yang terkandung dalam bahan
tersebut

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi

bahwa parameter-parameter kerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem
analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi ketika:
1) Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.
2) Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan
atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode
baku tersebut harus direvisi.
3) Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah
berubah seiring dengan berjalannya waktu.
4) Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh
analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.
5) Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara
metode baru dan metode baku.  
Terdapat parameter-parameter dalam validasi metode analisis (VMA)
baik dari versi USP (United States Pharmacopeia) dan ICH (International
Conference on Harmonization), berikut perbedaanya:

No. Parameter USP ICH

1 Presisi / Precision ✓ ✓
2 Akurasi / Accuration ✓ ✓
3 Batas Deteksi / Limit Of Detection ✓ ✓
4 Batas Kuantifikasi / Limit Of Quantification ✓ ✓
5 Spesifitas / Specifity ✓ ✓
6 Linearitas dan Kisaran / Linearity and range ✓ –
7 Linearitas / Linearity – ✓
8 Kekasaran / Ruggedness ✓ –
9 Ketahanan / Robustness ✓ ✓

7
 10 Kesesuaian sistem / System suitability – ✓

Dapat dilihat pada tabel diatas pada ICH tidak ada parameter validasi
metode analisis kekasaran (rudgedness) . Sedangkan pada USP tidak ada
parameter validasi metode analisis kesesuaian sistem. Parameter-parameter
validasi metode analisis (VMA) adalah parameter uji yaitu:

1. Akurasi / Accuracy

Akurasi atau ketepatan merupakan kemampuan suatu metode

analisa untuk memperoleh nilai yang sebenarnya (ketepatan pengukuran).
Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai
terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya,
atau nilai rujukan. Akurasi merupakan tingkat keyakinan hasil pengujian
dengan hasil sebenarnya. Akurasi harus dilakukan pada range spesifik
pada prosedur pengujian.
Akurasi diukur dengan melakukan “spiking” dari matriks sampel
dengan konsentrasi analit standar dan menganalisis sampel menggunakan
metode yang divalidasi. Pada prosedur dan dilakukan perhitungan akurasi
(% recovery juga) akan bervariasi dari satu matriks ke matriks lainnya.
Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan
pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang
berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus
dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali. Akurasi dinyatakan
sebagai presentase (%) perolehan kembali (recovery). Ketepatan metode
analisis dihitung dari bersarnya rata-rata kadar yang diperoleh dari
serangkaian pengukuran dibandingakn dengan kadar sebenarnya.
Terdapat lima metode dalam penentuan akurasi dari metode analisis
yaitu:
1) Menggunakan metode analisis untuk penentuan kadar analit dalam
bahan baku aktif yang telah diketahui kadar kemurniannya

8
2) Bahan baku aktif atau cemaran dalam jumlah yang diketahui. Jumlah
diketahui ditambahkan dalam plasebo. Cara ini untuk penerapan
kadar baku aktif/cemaran dalam produk obat
3) Verifikasi akutas metode dapat dilakukan dengan penambahan
standar adisi dalam jumlah tertentu pada produk obat yang telah
diketahui kadarnya. Ini dilakukan bila plasebo tidak dapat diperoleh.
4) Menambahkan cemran dalam jumlah tertentu yang telah diketahui ke
dalam produk obat. Metode analis ini digunakan untuk penerapan
kadar cemaran dalam bahan baku aktif dan produk obat
5) Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui
ekivalensinya. Ini dilakukan dengan cara membandingkan hasil yang
diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadapa hasil yang
diperoleh dari metode analis yang valid. Metode analisis ini
digunakan untuk penetapan kadar bahan baku aktif dalam bahan
baku aktif, produk obat dan penetapan kadar cemaran.

2. Presisi /Precision

Presisi atau ketelitian merupakan kemampuan suatu metode

analisis menunjukkan kedekatan suatu seri pengukuran yang diperoleh
dari sampel yang homogen. Presisi adalah ukuran keterulangan metode
analisis. Nilainya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif (Relative
Standar Deviation) atau RSD dari sejumlah sampel yang berbeda
signigikan secara statistik. Presisia diukur dengan injeksi seri standar
atau menganalisis seri sampel dari mutiple sampling dari lot yang
homogen, Dari beberapa sampel tersebut akan didapatkan rata-rata dan
dihitung nilai RSD-mya. %rsd atau CV = SD/Mean×100% Presisi dapat
dihitung menggunakan persamaan Horwitz. Persentase hasil RSD untk
presisi berdasarkan persamaan Horwitz. Persamaan ini merupakan
hubungan eksponensial antara RSD lab (RSDR) dan konsentrasi (C).
Terdapat tiga kategori dalam pengujian nilai presisi, yaitu:

9
 1) Keterulangan, nilai ini ditentukan dengan menggunakan minimum 9
penentuan dalam rentang penggunaan metode analisis (misalnya 3
konsentrasi/3 replikasi)
2) Presisi antara, merupakan perbedaam antar analis dengan sumbern
reagen dan hari yang berbeda
3) Reprodusibilitas, didapatkan dengan menggunakan beberapa
laboratorium untuk validasi metode analisis. Ini dilakukan dengan
tujuan mengetahui lingkungan yang berbeda terhadap kinerja metode
analisis.

Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya

menggunakan 2 parameter yang pertama, yaitu keterulangan dan presisi
antara. Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uji
banding antar laboratorium. Persyaratan RSD sebagai berikut ini:

No. Tipe Metode Analisis Persyaratan RSD (misal)

1. Prosedu Penetapan Kadar Bahan Aktif Obat tidak lebih dari 2%

Metode analisis untuk penetapan kadar
impuritas: tidak lebih dari 2%
2. Batas impuritas: 1-10% tidak lebih dari 10%
0,01% tidak lebih dari 20%
1 ppm
Persyaratan RSD untuk presisi

3. Spesifisitas

Spesifisitas atau selektifitas adalah kemampuan metode analisi

untuk mengukur secara akurat suatu analit dengan keberadaan
pengganggu yang berada dalam matriks sampel. Pengganggu merupakan
komponen-komponen lain dalam matriks semisal ketidakmurnian,
produk degradasi dan komponen dalam matriks sendiri. Spesifisitas
ditunjukkan dengan adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua
puncak yang berdampingan dan kemurnian tiap puncak dalam

10
kromatogram. Untuk instrument HPLC adalah Rs:1,2-1,5. Untuk
instrument spektofotometer UV/VIS adalah jarak antara dua puncak yang
berdampingan dengan resolution factor (Rf) > 2,5.
Dalam ICH dibagi spesifitas menjadi 2 kategori yaitu uji
identifikasi dan uji kemurnian. Uji identifikasi ditunjukkan dengan
kemampuan metode analisis membedakan antar senyawa yang
mempunyai stuktur molekul yang mirip. Uji kemurnian ditunjukkan oleh
adanya daya pisah 2 senyawa yang berdekatan (dalam kromatografi).
Senyawa-senyawa tersebut merupakan komponen utama atau komponen
aktif suatu pengotor. Jika dalam suatu uji terdapat pengorot maka metode
uji seharusnya tidak terpengaruh.

4. Batas Deteksi / Limit Of Detection (LOD)

Batas deteksi adalah kuantitas terkecil dari analit yang dapat

dideteksi dan tidak perlu sampai ditentukan nilainya secara kuantitatif.
Pendekatan instrumental dan non instrumental dapat digunakan, seperti:
1) Evaluasi visual. Evaluasi ini digunakan untuk metode analisis non
instumental, tapi dapat juga untuk metode analisis instumental. Batas
deteksi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang
diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar terendah yang dapat
dideteksi dengan baik.
2) Signal to noise ratio, rasio signal dengan noise
Pendekatan ini diterapkan pada metode analisi yang memberikan
baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukan dengan
membandingkan pengukuran signal sampel yang diketahui
mengandung analit dalam konsentrasi rendah dan blanko, kemudian
dapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang dapat dideteksi
dengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 : 1
umumnya dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas
deteksi.
3) Standar Deviasi dari respon terhadap slope (tingkat kemiringan)

11
4) Standar Deviasi dari blanko. Mengukur beberapa respon dari larutan
blanko dan hitung simpangan baku dari respon.
5) Kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi dibuat dengan contoh yang
mempunyai rentang di sekitar batas deteksi. Residu simpangan baku
(residual standard deviation) atau simpangan baku dari y-intercepts
dari garis regresi adalah σ (simpangan baku)

LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan

apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Rasio noise dengan
signal untuk LOD harus 1 banding 3.

5. Batas Kuantifikasi (Limit Of Quantitation) / LOQ

Batas kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dimana instument

dapat mendeteksi dan mengkuantifikasi. Batas kuantifikasi merupakan
jumlah konsentrasi analit paling kecil yang masih dapat diukur dengan
akurat (tepat) dan presisi (teliti) yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan. Perbandingan noise terhadap signal
adalah 1:10. Pendekatan LOQ adalah prosedur instrumental dan non
instrumental yang didasarkan pada:
1) Evaluasi visual ini digunakan untuk metode analisis non instumental,
akan tetapi juga dapat digunkan untuk metode analisis instumental.
Batas kuantifikasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap
sampel yang diketahui konsentrasinya dan menetapkan kadar
terendah analit yanf dapat ditentukan secara kuantitatif dengan
akurasi dan preseisi yang dapat diterima
2) Signal to noise ratio, perbandingan noise dengan signal
Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang
memberikan baseline noise. Penentuan rasio signal terhadap noise
dilakukan dengan membandingkan signal yang diukur dari sampel
yang mempunyai konsentrasi analit yang rendah dan blankonya,
kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang dapat

12
 ditetapkan secara kuantitatif dengan baik, umumnya pada rasio
signal terhadap noise 10:1.
3) Standar Deviasi dari respon dengan slope (kemiringan)
4) Standar Deviasi dari blanko Mengukur beberapa respon dari larutan
blanko dan hirung simpangan baku dari respon.
5) Kurva Kalibrasi. Kurva kalibrasi dibuat dengan contoh yang
mempunyai rentang di sekitar batas deteksi. Residu simpangan baku
(residual standard deviation) atau simpangan baku dari y-intercepts
dari garis regresi adalah

Yang digunakan untuk limit deteksi di laboratorium adalah nilai

LOQ, karena nilai LOQ dapat dipertanggungjawabkan untuk masalah
presisi dan akurasi yang didapatkan. LOD dan LOQ merupakan satu hal
yang sama yakni sama-sama konsentrasi terendah, dimana LOD lebih
rendah dari LOQ. LOQ mempunyai akurasi dan presisi yang dapat
diterima, sedangkan LOD merupakan konsentrasi terendah yang akurasi
dan presisinya tidak dapat diterima, artinya kemungkinan besar hasil
yang ditunjukkan tidak valid jika kadar sampel diantara LOD dan LOQ.
Oleh karena itu, yang digunakan sebagai konsentrasi terendah yang boleh
digunakan dalam metode tersebut adalah hasil dari LOQ.
Rumus LOD dan LOQ
LOD = x + 3SD
LOQ = x + 10SD
*x = rata-rata pengujian blanko
Rumus di atas adalah perhitungan LOD dan LOQ teoritis. Tetapi
hasil perhitungan dari rumus harus dilakukan konfirmasi dengan
melakukan pengujian kembali dengan konsentrasi yang dihasilkan pada
pengujian LOD.

6. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk

menunjukkan hubungan secara langsung secara langsung atau

13
proporsional antara respon detektor dengan perubahan kons entrasi analit.
Diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b
adalah kemiringan slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan
sumbu y. Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar
yang berbeda, kemudian dilihat apakah memberikan respons yang linear
apa tidak, yang ditunjukkan dengan nilai r ≥ 0,98.
Linearitas ditentukan dengan injeksi beberap seri standar larutan
stok menggunakan solven/fase gerak, pada minimum 5 konsentrasi yang
berbeda pada kisaran 50-150%. Grafik linearitas akan diplot manual
menggunakan Microsoft Excell (konsentrasi vs Respon area puncak).
parameter linieritas tidak harus dilakukan pada semua metode, tetapi
hanya untuk metode yang biasanya menggunakan instrument
laboratorium dan mengharuskan adanya pembuatan deret standar. Selain
linieritas, ada juga yang disebut rentang kerja. Rentang kerja adalah suatu
nilai atau batas yang dihasilkan dari pernyataan yang didasari oleh batas
terendah dan tertinggi dari konsentrasi analit yang mampu dideteksi
secara linier, akurat, dan presisi.

7. Kisaran (Range)

Kisaran adalah konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana

suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi dan linearitas yang
mencukupi. Kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis
metodenya. Kisaran diukur menggunakan baku dengan kisaran 25. 50,
75, 100, 125 dan 150% dari konsentrasi analit yang diharapkan. Kisaran
konsentrasi adalah kisaran dimana linearitas dilakukan.

8. Kekasaran (Ruggedness)

Kekasaran merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang

diperoleh dibawah kondisi yang bermacam-macam. Ini ditunjukkan
sebagai % RSD. Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analisis, alat,
reagen, dan waktu percobaan yang berbeda.

14
9. Ketahanan (Robustness) /Ketegaran

Ketahanan merupakan kapsitas suatu metode analisi untuk tidak

terpengaruh oleh variasi-variasi kecil dalam parameter metode analisis.
Contoh variasi-variasi kecil dalam pengujian dengan HPLC antara lain :
pH fase gerak, suhu, tekanan, stabilitas, konsentrasi buffer, flow rate,
suhu kolom dan lain-lain. Dalam metode analisis ada tahap-tahap kritis
dimana bila tidak dikerjakan secara hati-hati akan menimbulkan
kesalahan yang besar. Dilakukan dengan memvariasikan kondisi analisis
sedemikian rupa dan mengukur pengaruhnya terhadap presisi dan akurasi
yang dicapai. Parameter ini bertujuan untuk membantu dalam
mengantisipasi dan mengeliminasi sumber kesalahan yang mungkin
terjadi. Parameter ini juga mendemonstrasikan bahwa metode stabil
terhadap perubahan kondisi metode yang kecil.
Untuk uji robustness tidak perlu menghitung akurasi dan presisi
dikarenakan akurasi dan presisi utuk perbandingan kedua metode sudah
ditentukan dengan menggunakan uji beda nyata yakni uji f dan uji t.
Dimana hasil uji F digunakan untuk presisi dan hasil uji T digunakan
untuk akurasi. Hasil perhitungan kedua uji tersebut kemudian akan
dibandingkan dengan tabel masing-masing. Dimana hasil yang
diharapkan adalah F data T hitung < dari pada F atau T tabel, hal ini
menunjukkan bahwa akurasi dan presisi dari kedua metode tersebut tidak
berbeda nyata.
Presisi: Uji F
Akurasi: Uji T

10. Kesesuaian Sistem

Seorang analis harus memastikan bahwa sistem pengujian yang

dilakukan setiap haru memberikan data yang dapat diterima. Dalam USP
parameter-parameternya untuk mennetukan kesesuaian sistem antara
lain:
1) Jumlah lempeng teori (N)

15
2) Tailing factor
3) Kapasitas
4) Nilai RSD tinggi puncak
5) Luas puncak dari serangkaian injeksi

Elemen-elemen Data yang dibutuhkan untuk Uji Validasi

Baik USP maupun ICH keduanya menerangkan bahwa tidak selamanya
parameter untuk mengevaluasi validasi metode perlu diuji. 
USP membagi metode-metode analisis ke dalam kategori yang terpisah,
yaitu:
1) Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama atau bahan aktif.
2) Penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi.
3) Penentuan karakteristik-karakteristik kinerja
4) Pengujian identifikasi.

Menurut USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan

dalam 3 kategori, yaitu:
1) Kategori I Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar
komponen utama dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau
bahan aktif lainnya seperti pengawet.
2) Kategori II Metode analisis yang digunakan untuk penetapan
cemaran dalam bahan baku obat atau hasil degradasinya dalam
sediaan obat jadi.
3) Kategori III Metode analisis yang digunakan untuk penetapan
kinerja dan kualitas sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji
pelepasan obat.
4) Kategori IV Uji identifikasi

Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis

pengujian, yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan
keberadaan pengotor, serta uji kuantitatif komponen aktif atau komponen
lain dalam produk obat – obatan. Selain itu, terdapat 8 parameter validasi
metode analisis yaitu spesifitas, presisi atau ketelitian, akurasi atau

16
ketepatan, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitas dan
ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji tergantung dari jenis
dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004). Parameter ini
berkaitan dengan sejauh mana zat lain mengganggu identifikasi
atau analisis kuantifikasi analit. Ukuran dari kemampuan metode untuk
mengidentifikasi atau mengukur analit.
Kehadiran zat lain baik endogen maupun eksogen, dalam sampel
matriks dibawah kondisi yang dinyatakan metode ini. Kekhusussan
ditentukan dengan menambahakan bahan – bahan yang mungkin
dihadapi didalam sampel. Misalnya, tes spesifitas metode imunologi
untuk specimen biologi dapat berpotensi zat bereaksi mengganggu zat
yang dapat menghambat atau menutupi warna reaksi; metode
kromatografi untuk penentuan konsentrasi obat penyalahgunaan dalam
sampel klinis harus bebas dari gangguan dariyang diharapkan bersamaan
diberikan obat terapi. Spesifitas adalah tergantung konsentrasi dan harus
ditentukan pada akhir rendah dari kisaran kalibrasi. Untuk memenuhi
tujuan metode dan memastikan bahwa efek dari kotoran, zat bereaksi
silang, yang mungkin ada dalam matriks diketahui (Riyanto, 2014).
Dalam melakukan validasi metode analisa diperlukan perangkat untuk
melakukannya, yaitu:
1) Sample uji. Sampel ini diuji untuk memberikan presisi dan
interferensi yang dihitung setiap kali dilakukan pengujian. Hasil
pengujian akan menghasilkan penyimpangan dari hasil presisi
sampel yang diuji secara rutin. Sampel rutin yang digunakan adalah
sampel yang biasa digunakan dalam pengujian
2) Spking Material. Spiking material digunakan untuk melihat working
range suatu sampel yang memiliki konsentrasi dibawah limit deteksi
dari instument. Ini tidak harus dilakukan pada semua metode, hanya
metode tertentu yang memang di dalamnya mengharuskan untuk
adanya spiking material. Spiking dilakukan jika kadar dalam sampel
dibawah limit deteksinya.

17
3) Incured Material. Incured material adalah penggunaan sampel yang
tidak mengandung analit.
4) Standar. Standar atau CRM (Certified Reference Material)
digunakan berdasarkan kebutuhan.
5) Blanko. Blanko digunakan untuk menjadi kontrol chart dalam
pengujian. Blanko ada 2 yaitu blako sampel dan blanko reagen.
Blanko sampel adalah sampel murni tanpa danya analit. Blanko
sampel dibuat dengan cara dilakukan pengenceran sebanyak-
banyaknya hingga analit hilang. Blanko reagen adalah blanko yang
didalamnya hanya ada pereaksi dilakukan dalam pengujian tersebut.
6) Statistika. Ilmu statistika digunakan untuk menghitung dan
menetapkan parameter keberterimaan. Statistika dasar yang dihitung
adalah rata-rata, RSD, % RSD, uji T dan Uji F.

Metode analisis harus dipelihara sehingga selalu dalam keadaan

tervalidasi selama digunakan rutin dalam pengujian. Revalidasi metode
analisis dari sebuah prosedur pengujian dilakukan bila terdapat
perubahan-perubahan antara lain:
1) Perubahan pada fase gerak
2) Perubahan pada kolom HPLC
3) Perubahan suhu pada kolom HPLC
4) Perubahan konsentrasi/komposisi dari sampel dan standar
5) Perubahan detektor (misalnya berubah dari detektor UV-Visibel
menjadi detektor fluorimetri atau perubahan rentang gelombang)

Periode revalidasi metode analisis harus ditentukan dengan ilmiah

atau bisa juga dengan kajian risiko mutu. Revalidasi dilakukan untuk
memastikan performa karakteristik penting seperti spesifitas, presisi,
akurasi dan yang lain-lain tetap memenuhi syarat. Tingkat dari revalidasi
tergnatung dari sejauh apa perubahan tersebut.

18
D. Elemen-Elemen Data Yang Dibutuhkan Untuk Uji Validasi

Farmakope Amerika (United States Pharmacopeia, USP) maupun

ICH (International Conference on Harmanization) telah memperkenalkan
bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi validasi metode perlu
diuji.
USP membagi metode-metode analisis ke dalam 3 kategori yang
terpisah, yaitu:
1. Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama atau bahan aktif
2. Penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi
3. Penentuan karakteristik-karakteristik kinerja
4. Pengujian identifikasi

Untuk uji kategori 1, evaluasi nilai LOD dan LOQ tidak begitu
penting karena komponen utama atau bahan aktif pada umumnya berada
dalam jumlah yang besar.
Pengujian kategori 2 dapat dibagi lagi menjadi 2 sub-kategori, yaitu
analisis kuantitatif dan uji batas. Jika yang diharapkan adalah informasi
kuantitatifnya maka parameter LOD tidak begitu penting, tetapi parameter
yang lain dibutuhkan. Keadaan yang berlawanan berlaku untuk uji batas,
karena informasi kuantitatifnya tidak dibutuhkan maka pengukuran LOD,
spesifisitas, dan kekasaran sudah mencukupi. Untuk mengetahui elemen-
elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi dapat dilihat pada tabel
berikut:

19
 Sementara itu karakteristik validasi menurut ICH (International
Conference on Harmanization) dan jenis prosedur analisisnya dapat dilihat
pada table berikut:

20
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

1. Kesesuaian system (system suitability) Proses validasi dimulai dengan

perangkat lunak yang tervalidasi dan system yang terjamin, lalu metode
yang divalidasi menggunakan system yang terjamin dikembangkan.
Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode
yang sudah atau tidak reliabel (presisi dan akurasinya rendah).Metode
yang telah ada tidak memberikan sensivitas atau spesifitas yang
mencukupi pada sampel yang dituju. Instrumentasi dan tehnik yang lebih
baru memberikan kesempatan untuk meningkatkan kinerja metode
tersebut, yang meliputi peningkatan identifikasi analit, peningkatan batas
deteksi, serta akurasi dan presisi yang lebih baik
2. KI dilaksanakan pada yang mencakup instalasi peralatan, pipa dan sarana
penunjang dan instrumentasi yang sesuai dengan spesifikasi dan gambar
teknik yang didesain, pengumpulan dan penyusunan dokumen
pengoperasian dan perawatan peralatan dari pemasok, ketentuan dan
persyaratan kalibrasi serta verifikasi bahan konstruksi. KO mencakup
pengujian yang pengujian yang perlu dilakukan berdasarkan pengetahuan
tentang proses, sistem dan peralatan serta mencakup pengujian yang
terdiri dari 1 atau beberapa kondisi batas operasional atas dan bawah atau
yang sering disebut dengan kondisi terburuk.
3. Validasi Metode Analisis Validasi metode merupakan suatu proses
(percobaan laboratorium) untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja
metode analisis telah memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan
sebelumnya. Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode
analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang
akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2014). Validasi metode analisis
dilakukan idealnya pada semua metode analisis yang digunakan untuk

21
 pemeriksaan. Sebagai tambahan, validasi memastikan bahwa suatu
prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas sehingga dapat
dilaksanakan oleh analis atau laboratorium yang berbeda dengan hasil
yang sebanding. Parameter –parameter VMA adalah parameter uji yaitu:
akurasi, presisi, spesifitas, batas deteksi, batas kuantifikasi, linearitas,
kisaran, kekasaran, ketahanan, kesesuaian system.
4. Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uju validasi yaitu : Pengujian
identifikasi Untuk uji kategori 1, evaluasi nilai LOD dan LOQ tidak
begitu penting karena komponen utama atau bahan aktif pada umumnya
berada dalam jumlah yang besar.

B. Saran

Semoga makalah ini bermanfaat bagi pembaca dan saya harap kritik dan
sarannya.

22
 Daftar Pustaka

Ahuja, S., dan Dong, M, W, Eds. 2005. Handbook of Pharmaceutical Analysis by

HPLC, Edidi Pertama, Elsevier, Inc: United Kingdom
BPOM. 2018. Pedoman Cara Pembuatan Obat Yang Baik (CPOB). Jakarta:
Badan Pengawas Obat dan Makanan.
Chan, C.C. et al. 2004. Analytical Method Validation and Instrument
Performance Verification. Willer Interscience. New Jersey, dikutip dari
Anonim. 2012. http://repository.upi.edu/operator/upload/s_kim_0700710_
chapter2.pdf 6 Agustus 2021.
Gandjar, G. I., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Belajar,
Yogyakarta.
Gandjar, G. I., dan Rohman, A., 2014, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Belajar,
Yogyakarta.
Gholib, Ibnu. 2008. Kimia Analisis Farmasi. Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta. Pustaka Pelajar.
International Conference on Harmonization [ICH]. Validation of Analytical
Prosedures: Methodology Q2B [terhubung berkala]. www.ich.org. 1995.
International Conference on Harmonization [ICH]. Validation of Analytical
Prosedures: Text and Methodology Q2 (R1) [terhubung berkala].
www.ich.org. 1995.
Riyanto, 2014, Validasi dan Verifikasi Metode Uji, Deepublish: Yogyakarta.
U.S. Pharmacopeia. 2007. The United States Pharmacopeia, USP 30/ The
National Formulary, NF 25. Rockville, MD: U.S. Pharmacopeial
Convention, Inc., p. 2653.
United States Pharmacopeial Convention. 2014. The United States
Pharmacopedia 37 - National Formulary 32 (USP37-NF32). 37 th Edition.
Rockville USA: United States Pharmacopeial Convention Inc.

23