Kalibrasi HPLC

Merupakan penampilan hasil instrument atau peralatan dengan batasan yang ditentukan
pada rentang standar sesuai referensi.

- Berikut merupakan jadwal kalibrasi HPLC

Parameter kalibrasi HPLC meliputi:

a. Akurasi laju alir

- Kriteria yang dapat diterima : waktu yang dibutuhkan untuk mengumpulkan air harus
+ 2% dari nilai sebenarnya.
Tabel 1. Akurasi Laju alir

b. Akurasi injector
- Dilakukan langkah penimbangan vial yang berisi air (Mili-Q water) 2/3 vial sebelum
dimasukkan dalam sistem HPLC sehingga diperoleh bobot (W1). Vial kemudian
dimasukkan dalam sistem kemudian dilakukan penginjekkan 6x dalam sejumlah
volume tertentu dalam mikrolit dari vial). Vial ditimbang sehingga diperoleh (W2)
- Menghitung volume rata-rata yang diinjeksikan per injeksi
Rata volum yng diinjeksikan (μl) = (W1 - W2) x 100/6
- Kriteria yang dapat diterima = rata volum yang diinjeksi harus 50 + 1μl
c. Presisi sistem
- Melakukan preparasi standard dengan menginjekkan blanko diikuti preparasi standard
dengan 6x replikasi. Area dan waktu retensi dicatat
 Kriteria yang dapat diterima: %RSD waktu retensi dan luas area <1%.
d. Akurasi panjang gelombang
- Membuat metode panjang gelombang dalam nm dan injekkan blanko, diikuti
preparasi standard an dicatat tinggi atau absorbansinya.
- Kriteria: absorbansi maksimum + 2 nm.
e. Linieritas detektor
- Dibuat 5 larutan dari larutan standard dengan konsentrasi berbeda. Injek blanko,
diikuti linieritas larutan detektor dan lihat peak respons. Dibuat plot antara
konsentrasi standard dengan peak respons.
- Kriteria r2 > 0,99
f. Linieritas injector
- Diinjek 5 μl untuk blanko. Injek 5, 10, 20, 50, 80 μl untuk larutan standard. Buat
kurva volume injeksi vs luas area
- Kriteria: r2 > 0,99
g. Gradient Performance Check
- Melakukan gradient performance check. Hasilnya seperti tabel di bawah:
 - Kriteria: %tinggi + dari komposisi yang disetting.

h. Akurasi suhu kolom

- Thermometer dikalibrasi pada suhu 30oC dan 60oC. tunggu sampai thermometer
stabil. Catat display suhu pada thermometer.
- Kriteria: hasil suhu oven pada display thermometer harus +2oC pada temperature
yang disetting

(Gowrisankar et.al; 2010).

Gowrisankar, D., K. Abbulu., O.Bala, S., K.Sujana. 2010. Validation an d Calibration of

Analytical Instruments. Journal Biomed Sciences and Research, vol 2 (2).
 Verifikasi

Verifikasi merupakan suatu konfirmasi, berdasar bukti-bukti berupa hasil tes dimana
beberapa persyaratan yang telah ditentukan terpenuhi. Hasil proses verifikasi dapat berupa:

1. Peralatan pada kondisi kerja yang baik dan kinerjanya benar. Dalam hal ini, tanggal
verifikasi selanjutnya dijadwalkan;
2. Peralatan tidak dalam kondisi kerja yang sempurna;
3. Peralatan tidak dapat digunakan dan harus diperbaiki atau disesuaikan.

-Verifikasi alat meliputi presisi injector dan laju alir, kebenaran laju alir, linieritas detektor, noise
and drift, akurasi gradient.
-Untuk mengevaluasi kemampuan injector, sampel diinjekkan dan direplikasi 5x dengan
konsentrasi tertentu. Sehingga diperoleh rata-rata SD (Standar Deviasi), RSD (Standar
Deviasi Relatif), dan koefisien variasi (CV) yang diperoleh dari luas area pada kromatogram
pada presisi injector. Presisi injector dievaluasi dengan nilai CV.
-Presisi laju alir diperoleh dari nilai koefisien variasi dari waktu retensi 5x replikasi injeksi.
-Linieritas detektor diuji dengan menginjek larutan standar dengan 5 konsentrasi yang berbeda.
Kemudian akan diperoleh koefisien regresi
-Pengukuran noise dalam detektor diperlukan karena noise dapat mengurangi sensitivitas
detektor. Detektor drift mempengaruhi baseline dan integrasi peak, sehingga diperlukan untuk
deteksi peak pada detektor.
-Kalkulasi yang dibutuhkan untuk verifikasi didokumentasikan seperti pada gambar berikut.
(Zacarias, 2010)
Zacarias, M.I.G. 2010. Verification and Maintenance of Analytical Instruments According to
ISO/IEC 17205 Standard, European Master In Quality In Analytical Laboratories