Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara lama yang digunakan

secara luas, terutama dalam analisis campuran yang rumit dari sumber alam. Tetapi dalam
kuantisasi belakangan ini kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High
Performance Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi
(Munson, 1991).

KLT perlu dilakukan dengan tujuan untuk melakukan monitoring keberadaan

senyawa hasil ekstrak atau fraksinasi. Prosedur pemisahan ini dikatakan paling baik
karena tidak melibatkan pH dan suhu ekstrim maupun asam-basa sehingga dapat
mempertahankan struktur maupun sifat biologis sampel. Keuntungan metode ini yaitu
dapat menguji secara kualitatif banyak senyawa secara bersamaan, dapat dilakukan
dengan mudah tanpa sumber listrik, cepat dan datanya reliabel, sistem peralatan
sederhana, murah dan mudah dimodifikasi. Prinsip KLT tradisional sangat sederhana,
yakni campuran solut yang akan dipisahkan ditotolkan pada permukaan lempeng tipis
lalu dikembangkan di dalam chamber menggunakan fase gerak yang sesuai. Kekuatan
interaksi yang berbeda antara molekul solut dengan fase diam atau fase gerak akan
menghasilkan mobilitas dan pemisahan yang berbeda (Rohman dan Gandjar, 2007). Ada
beberapa hal yang perlu menjadi perhatian saat melakukan KLT yaitu:

a. Plat silica gel

Plat silica gel yang digunakan diberi batas atas dan batas bawah. Batas atas untuk
memudahkan saat akan melakukan monitoring sehingga diketahui batas berhentinya
eluen. Batas bawah disesuaikan dengan volume tepat mencapai tinggi batas didasar
chamber..

b. Penotolan sampel

Penotolan sampel sulit untuk diukur. Namun pada umumnya digunakan sebanyak 0,5 μl.
Pada praktikum ini penotolan menggunakan pipa kapiler. Totolan sampel diusahakan
tidak terlalu pekat (agak encer) karena sampel yang terlalu pekat, ketika elusi naik secara
berurutan akan terdapat noda-noda yang tertinggal berupa garis yang akan menggangu
hasil pengamatan dan pergerakan senyawa yang diperoleh. Solusinya adalah dengan
melakukan pengenceran kembali. Pada saat akan melakukan penotolan hal lain yang
penting adalah, sampel diencerkan dengan pelarut yang sesuai atau yang sama dengan
pelarut yang digunakan saat ekstrak agar senyawa yang dimaksud dapat terekstrak
dengan sempurna dan senyawa lain tidak ikut larut.

c. Metode penampak bercak

1) Dilihat secara visual untuk senyawa-senyawa berwarna

2) Dilihat dibawah sinar UV 254 nm untuk senyawa-senyawa yang dikembangkan

diatas plat yang diimpregnasi dengan fosfor yang didapat berpendar dibawah
lampu UV 254 nm. Bercak akan nampak sebagai spot hitam akibat terjadi
pemadaman fluorosensi sorbent.

3) Dilihat dibawah sinar UV 254 366 nm untuk senyawa-senyawa yang

berflouresensi alami.

4) Ditambahkan pereaksi membentuk warna dengan penyemprotan. Penyemprotan

sampel dilakukan dengan harapan diperoleh golongan senyawa yang dimaksud
pereaksi tersebut. Perbedaan warna yang terjadi menunjukkan kelompok
senyawanya. Pada praktikum ini digunakan dua senyawa pereaksi yaitu serium
sulfat untuk mendeteksi senyawa terpenoid akan membentuk warna ungu
kehitaman dan sitoborat untuk mendeteksi senyawa flavonoid akan membentuk
warna orange.

d. Penentuan nilai Racing Factor (Rf)

Penentuan nilai Rf bertujuan untuk mengidentifikasi golongan senyawa yang ada pada
sampel. Adapun faktor yang mempengaruhi nilai Rf adalah:

1) Silica gel polar mudah mengikat uap air (OH) sehingga silica gel harus diaktifkan
terlebih dahulu dengan dipanaskan atau dengan hair dryer agar gugus OH dapat
menguap karena adanya OH dapat mengganggu reaksi karena mudah berikatan
dengan pelarut polar.

2) Ketebalan lapisan juga mempengaruhi nilai Rf.

3) Kejenuhan Chamber. Kejenuhan wadah yang digunakan (eluen). Jika tidak jenuh,
pengembangan tidak maksimal karena hanya akan membawa pelarut dari bawah ke
atas. Terkadang naik bersama pelarut hanya membentuk garis lurus diatas sehingga
seolah-olah tidak ada kandungan senyawanya.

4) Memasukkan plat juga harus dilakukan dengan hati-hati. Pastikan plat tidak saling
bersentuhan dengan kertas saring atau plat silica gel yang lain. Kemudian diletakkan
tegak lurus agar tidak mendorong ekstrak pada satu sisi. Kemudian chamber segera
ditutup setelah plat dimasukkan agar eluen tidak menguap.