KELOMPOK 16 :

NELLY MAYESTI MANALU

SRIWULAN AYUNINGTYAS
Pengertian
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT/HPLC)

Merupakan metode yang tidak destruktif dan

dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif
dan kuantitatif. teknik pemisahan yang diterima
secara luas untuk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam
berbagai bidang, antara lain: farmasi,
lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-
industri makanan.
SRIWULAN AYUNINGTYAS (151650017)
Keuntungan dan kelebihan KCKT
Kelebihan
 HPLC dilengkapi dengan adanya
pompa, Pompa ini menghasilkan
tekanan sekitar 400 atm untuk
mengalirkan eluen dengan
tekanan tinggi dan konstan.
 HPLC memiliki keunggulan
kolom, Dimana kolom HPLC ini
lebih pendek dan lebih kecil.
 kromatogram menunjukkan hasil
yang didapat. Kromatogram yang
diinginkan adalah kromatogram
yang lurus tinggi dengan lebar
sekecil mungkin.
Kekurangan
 Larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu
 Hanya bisa digunakan untuk
asam organik
 Harus mengetahui kombinasi
yang optimum antara pelarut,
analit, dan gradient elusi
 Harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup
penelitian yang terbatas
Prinsip Kerja KCKT
 Alat Kromatografi KCKT

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas:

1. wadah fase gerak (Reservoir)
2. Pompa
3. alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi)
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak dan,
7. Komputer atau integrator atau perekam.
Lanjutan...
1. Wadah Fase Gerak
Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium
dapat digunakan sebagai wadah
fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1
sampai 2 liter pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus
dilakukan deggasing
(penghilangan gas) yang ada
pada fase gerak.
2. Pompa
Penggunaan pompa atau
sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan
bebas dari gangguan. Tiga jenis
pompa yang digunakan dalam
HPLC :
 Pompa reciprocating
 Pompa displacement
 Pompa pneumatic
3. Tempat Injeksi 4. Kolom

Sampel yang akan dimasukkan

ke bagian ujung kolom, harus
dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom. Sampel yang
akan dipisahkan dimasukkan ke
dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena
mempunyai sampel loop dengan
variabel volume (misalnya 20 –
500 μL).
Ada tiga tipe dasar injektor
yang dapat digunakan :
 Stop flow
 Septum
 Loop Valve
Ada 2 jenis kolom
pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana
terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses
pemisahan solut atau
analit.
5. Detektor

Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan

yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara
umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif). Seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik dan selektif, seperti detektor
UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Beberapa
detektor yang paling sering digunakan pada KCKT :
a. Detektor Spektrofotometri UV-Vis
b. Detektor photodiode-array (PDA)
c. Detektor fluoresensi
d. Detektor indeks bias
e. Detektor elektrokimia
6. Komputer, Intergrator atau Rekorder
alat pengumpul data seperti komputer,
integrator, atau rekoder, dihubungkan
dengan detektor. Alat ini akan mengukur
sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu
kromatogram yang selanjutnya dapat
dievaluasi oleh seorang analis (pengguna).
 Aplikasi KCKT
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
• HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
• Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai
polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
• Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori
• Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin
Zipax-SAX
• Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
• Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk
memisahkan golongan-golongan takatsiri
• HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri.
 Rumus Perhitungan KCKT
Metode Baku Dalam (Internal Standard Method) :
Dari kromatogram standar dapat dihitung respons
faktor relatif sebagai berikut :

r = Respons faktor relatif

C = Konsentrasi Kornponen Sampel
A = Lebar atau Tinggi Puncak Komponen Sampel
Cs = Konsentrasi Baku Dalam
As = Lebar atau Tinggi Baku Dalam

NELLY MAYESTI MANALU (151650011)

Lanjutan ...
Di dalam campuran sampel digunakan rumus berikut
:

Cu = Konsentrasi komponen sampel

Au = Lebar atau Tinggi Puncak
Cs = Konsentrasi Baku Dalam
As = Lebar atau Tinggi Puncak Baku Dalam
 Soal Perhitungan
• Tablet analgetik yang dibeli di Apotik pada etiketnya tertera setiap
tablet mengandung 325 mg Aspirin dan 50 mg Kafein.

• Prosedur Kerja : Ambil dua Tablet tambahkan 0,0773 g Fenasetin

kocok dengan 10 ml etanol selama 10 menit, clan tambahkan 10
ml ammonium format 0,5 mol dm-3 dan campuran ini diencerkan
dengan fase gerak sampat 100 ml. Tablet mengandung bahan-
bahan pembawa, maka larutan ini harus disaring sebelum
dikromatografi. Dengan kondisi percobaan yang digunakan ketiga
senyawa tersebut dapat dipisahkan dalam waktu sekitar 3 menit.

• Dilakukan penimbangan Standar dari senyawa-senyawa di atas

dan diencerkan sehingga konsentrasinya mendekati konsentrasi
sampel dan dinjeksikan ke sistem kromatografi sebanyak tiga kali,
diperoleh data-data sebagaimana
Data hasil perhitungan respons faktor relatif
Aspirin dan Kafein

Data sampel Aspirin dan Kafein dengan buku

dalam Fenasetin
Hitung respons faktor relatif, kadar Aspirin dan Kafein dalam
tablet. Persyaratan Farmakope untuk Aspirin diantara 95 %
dan 105 % sedangkan Kafein di antara 90 % dan 110 %.
Apakah tablet tersebut memenuhi persyaratan ?
Jawab :
• Untuk Injeksi 1 :
Kadar aspirin
Cu = 157595 * 8,908 * 0,0773 = 0,6353 gr dalam 2 tablet
170804
= 0,31765 gr dalam 1
tablet
Kadar Kafein
Cu = 50693 * 4,555 * 0,0773 = 0,1045 gr dalam 2 tablet
170804
= 0,0522 gr dalam 1 tablet
• Untuk injeksi 2 :
Kadar aspirin
Cu = 153541 * 8,908 * 0,0773 = 0,6440 gr dalam 2 tablet
164174
= 0,322 gr dalam 1 tablet

Kadar Kafein
Cu = 48478 * 4,555 * 0,0773 = 0,1040 gr dalam 2 tablet
164174
= 0,0520 gr dalam 1 tablet
• Kadar rata–rata Aspirin = 0,31765 + 0,322 = 0,3198 gr
2
• Presentase Aspirin = 319,8 x 100% = 98,4 %
325
• Kadar rata–rata Kafein = 0,0522 + 0,0520 = 0,0521 gr
2
• Persentase Kafein = 52, 1 x 100 % = 104,2 %
50
Berarti kadar Aspirin dan Kafein memenuhi
persyaratan Farmakope.
 Kesimpulan
• KCKT merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan
kualitatif maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada
senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak
dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.

• HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam

dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-
jenis HPLC sebagai berikut: kromatografi adsorbs, kromatografi
fase terikat, kromatografi penukar ion, kromatografi pasangan ion,
Kromatografi eksklusi ukuran dan kromatografi afinitas.

• Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit – analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa
diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya.
 Daftar Pustaka
Ahmad, M. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Surabaya: Airlangga University
Press.

Gandjar, Ibnu G. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Kealey and Haines, P.J. 2002. Analytical Chemistry. London: BIOS Scientific
Publishers Ltd.

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.

Munson, J.W. 1981. Analisis Farmasi Metode Modern. Surabaya: Universitas
Airlangga.

Settle, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry,

Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.

Underwood, D. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi VI. Jakarta: Erlangga.

Zulkarnaen, AK. 1991. Kimia Analisa Kuantitatif. Yogyakarta: Departemen

Perindustrian SMTI.