M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |1

PERCOBAAN 1

PEMISAHAN ZAT WARNA DENGAN KROMATOGRAFI KERTAS

A. Tujuan
Mampu melakukan pemisahan pigmen pada spidol dengan kromatografi kertas.
B. Dasar Teori
- Kromatografi Cair – Cair (Kromatografi Partisi)
- Fase diam : air yang terserap pd kertas
- Fase gerak : pelarut/eluen
- Fase diam sifatnya polar  senyawa pada sampel yang lebih polar akan tertahan kuat
pada fase diam sehingga nilai Rf rendah  kepolaran tinggi
- Tahap kromatografi kertas
a. Penotolan cuplikan
b. Tahap pengembangan
c. Tahap identifikasi/ penampakan noda
- Noda Tidak Berwarna :
a. Penyemprotan pereaksi penimbul warna, ditizan, ninhidrin, kalium kromat,
amonium sulfida.
b. Menyinari kertas dengan sinar UV
c. Mendedahkan kertas pada uap iodium
d. Tentukan Rf
C. Alat
- Gelas beaker / chamber
- Penggaris
- Pipet kapiler
- Pensil
- Spidol warna coklat/hitam, ungu/biru, dan pink/merah.
- Cawan petri
- Gelas kimia
- Pipet ukur 10 ml
- Pipet tetes
- Pinset
D. Bahan
- Kertas saring, dan
- Eluen (alkohol dan air)
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |2

E. Langkah Kerja
Kromatgrafi Menaik (Ascending)
1. Menyiapkan empat gelas beaker/chamber, kemudian mengisi dua gelas beaker
pertama dengan air 10 ml, sedangkan dua chamber selanjutnya dengan alkohol.
2. Menyiapkan 2 kertas berukuran 4 x 8 cm dan 8 x10 cm.
3. Memberi garis 1 cm dari salah satu ujung kertas dan 1 cm dari ujung kertas lainnya.
4. Menotolkan spidol warna ungu, coklat, dan pink pada salah satu ujung yang sudah
digaris.
5. Memasukkan kertas saring yang telah mendapatkan totolan ke dalam chamber dan
membiarkan terjadi elusi sampai batas atas yang telah ditandai
6. Mengeluarkan kertas saring dari chamber setelah terjadi elusi.
7. Menghitung nilai Rf dari setiap noda yang terbentuk.
𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛
Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛

Kromatografi Menurun ( Desending)

1. Menyiapkan dua cawan porselen, kemudian mengisi cawan pertama dengan air
sedangkan cawan kedua dengan alkohol.
2. Menyiapkan 2 kertas berukuran 2 x 15 cm.
3. Memberi garis 1 cm dari salah satu ujung kertas dan 1 cm dari ujung kertas lainnya.
4. Menotolkan tinta coklat, ungu, dan pink pada salah satu ujung yan sudah digaris.
5. Meletakkan cawan porselen di atas gelas beaker 500 ml.
6. Memasukkan ujung kertas yang telah mendapatkan totolan ke dalam cawan porselen,
sedangkan sebagian membiarkan ujung lainnya terjuntai ke bawah.
7. Menutup cawan porselen dengan gelas beaker yang lebih besar.
8. Mengeluarkan kertas saring dari cawan setelah terjadi elusi.
9. Menghitung nilai Rf dari setiap noda yang terbentuk.

𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛

Rf = 𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑒𝑙𝑢𝑒𝑛
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |3

PERCOBAAN 2

PEMISAHAN ZAT WARNA PADA BAHAN ALAM (DAUN PANDAN SUJI, BAYAM
DAN KUNYIT) DENGAN KROMATORGAFI LAPIS TIPIS

A. Tujuan
Memisahkan zat warna pada bahan alam yakni daun pandan suji, bayam, dan kunyit dengan
kromatografi lapis tipis
B. Dasar Teori
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel
yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan
perbedaan kepolaran Kromatografi Lapis Tipis. Pelaksaanan kromatografi lapis tipis
menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng
gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam.
Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana
dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase
gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Dasar pemisahan pada KLT adalah perbedaan kecepatan migrasi diantara fasa diam
yang berupa padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solven (eluen) yang juga
dikenal dengan istilah pelarut pengembang campur.
Jenis eluen yang digunakan tergantung jenis sampel yang akan dipisahkan. Eluen
yang menyebabkan seluruh noda yang ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat
(“solvent front”) tanpa mengalami pemisahan, dikatakan terlalu polar. Sebaliknya apabila
noda yang ditotolkan sama sekali tidak bergerak, berart eluen tersebut kurang polar.
Cara termudah untuk memilih jenis eluen yang tepat adalah dengan menggunakan
metode cincin terkonsentrasi. Hasil yang diperoleh dapat digambarkan dengan gambar
berikut :

Lapisan Luar Pelarut (solvent front)

Noda
sampel

Kurang polar Cukup polar

Terlalu
Perhitungan Nilai Rf
Polar
Pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-
senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut
dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |4

bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut
ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛
𝑅𝑓 =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡
Dua senyawa dikatakan berasal dari senyawa identik dan sama bila berada dalam
satu pelat, pelarut yang memiliki tingkat kepolaran yang cukup dan mempunyai nilai Rf
sama.
C. Alat
1. Pelat KLT berukuran 7 x 2 cm 2 lembar, pelat 3 x 5 cm 2 lembar
2. Pipa kapiler untuk menotolkan noda 6 buah
3. Gelas yang memiliki dasar rata, lurus, diameter ± 10 cm dan tinggi ± 7 cm
4. Corong pemisah dengan ukuran sesuai sebanyak 2 buah (untuk satu kelas)
5. Kertas saring Whatman selebar bagian dalam gelas
6. Pelat kaca untuk menutup gelas
7. Vial-vial kecil 6 buah yang sudah dicuci bersih dan dikeringkan
8. Pinset panjang
D. Bahan
1. Metanol dan Etanol (for chromatograhy) 100 ml untuk satu kelas
2. Heksana untuk eluen sesuai perbandingan H : K : E
3. Kloroform untuk eluen sesuai perbandingan H : K : E
4. Etanol untuk eluen sesuai perbandingan H : K : E
5. Daun pandan betawi (daun suji) yang sudah disaring ±15 gram untuk satu kelas
6. Kunyit yang sudah diparut ± 25 gram untuk satu kelas
E. Langkah Kerja
1. Persiapan Sampel
Pertama-tama 15 gram daun pandan yang sudah ditumbuk direndam dengan 10
mL metanol sampai warnya cukup tua dan diambil filtratnya. Kemudian dimasukkan
kedalam corong pisah dan ditambahkan 16 mL dikloro metana, lalu dilakukan ekstraksi
sampai terbentik 2 lapisan.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |5

Kedua 15 gram kunyit yang sudah ditumbuk direndam dengan 10 mL metanol sampai
warnya cukup tua dan diambil filtratnya. Kemudian dimasukkan kedalam corong pisah
dan ditambahkan 16 mL dikloro metana, lalu dilakukan ekstraksi sampai terbentik 2
lapisan.
2. Persiapan Pelat
Pelat yang akan digunakan mula-mula dimasukkan kedalam oven selama 15 menit.
Untuk percobaan dengan metode cincin terkonsentrasi digunakan pelat berukuran 3 x 5
cm. Pelat tersebut diberi titik-titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda. Jarak
antar titik ± 1 cm, sehingga setiap pelat dapat memuat 6 titik. Untuk penentuan Rf pelat
KLT berukuran 2 x 5 cm diberi batas dengan menggunakan pensil, untuk batas bawa
sekitar 1 cm dan batas atas 0,5 cm.
3. Persiapan Eluen
a. Untuk Cincin Terkonsentrasi
Campuran dari heksana, kloroform dan etanol diditeteskan kedalam plat tetes
dengan perbandingan sebagai berikut :
A. 1 : 4,5 : 4,5 D. 4 : 3 : 3
B. 3 : 4: 3 E. 4,5 : 4,5 : 1
C. 3 : 3 : 4 F . 4,5 : 1 : 4,5
b. Untuk Penentuan Rf
Dimasukkan kertas saring ke dalam gelas sedemikian sehingga kertas tersebut
menutupi seluruh dinding gelas namun tidak sampai melebihi bagian atas gelas.
Selanjutnya dimasukkan 5 mL campuran heksana, kloroform dan etanol dengan
perbandingan yang paling tepat (sesuai dengan hasil pada percobaan cincin
terkonsentrasi) dan ditutup dengan pelat kaca sampai kertas saring basah seluruhnya.
4. Tahap Penotolan dan Pengembangan Sampel
a. Untuk cincin terkonsentrasi
Sampel ditotolkan sebanyak 2-3 kali dengan pipa kapiler pada 6 titik di
pelat KLT sampai warna cukup jelas pada tempat yang sama. Kemudian diberi
kode A-F untuk setiap noda. Lalu diambil campuran pada vial A dengan pipa
kapiler dan ditotolkan pada noda A. Kemudian diamati bentuk cincin yang
terjadi dan dilakukan hal yang sama pada noda B-F serta ditentukan
perbandingan eluen mana yang sesuai dengansampel.
b. Untuk Penentuan Rf
Pigmen daun pandan suji dan pigmen kunyit ditotolkan pada batas bawah
pelat sebanyak 2-3 kali. Lalu Dibuka pelat kaca dan dimasukkan pelat ke dalam
gelas dengan pinset, posisi pelat bagian bawah menyentuh dasar gelas (tidak
miring), jangan sampai noda terkena eluen. Kemudian segera ditutup gelasnya
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |6

dan dibiarkan mengembang eluennya hingga menyentuh batas atas. Setelah itu
diamati noda yang terjadi dan diberi tanda dengan pensil. Lalu dikeringkan dan
ditutup dengan selotip serta dihitung nilai Rf setiap komponen.

Persiapan Sampel

Daun Pandan Betawi / Bayam

- Ditumbuk
- Ditimbang ± 25 gram
- Direndam dalam 25mL methanol sampai larutan berwarna cukup tua
- Diambil filtratnya
- Dimasukkan dalam corong pisah
- Ditambah ± 25mL kloroform
- Dikocok baik – baik dengan arah yang sama sambil sekali – kali dibuka
tutupnya
- Diambil lapisan bawah

Pigmen Sampel

Kunyit

- Ditumbuk
- Ditimbang ± 25 gram
- Direndam dalam 25mL etanol sampai larutan berwarna cukup tua
- Diambil filtratnya
- Dimasukkan dalam corong pisah
- Ditambah ± 25 mL kloroform
- Dikocok baik – baik dengan arah yang sama sambil sekali – kali dibuka
tutupnya
- Diambil lapisan bawah

Pigmen Sampel
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |7

 Persiapan Pelat

Pelat KLT 3x5 cm

- Dimasukkan dalam oven sekitar 10 menit

- Diberi titik – titik dengan pensil untuk tempat menotolkan noda sebanyak 6
titik
- Diberi jarak antar titik ± 1cm

Pelat cincin terkonsentrasi

Pelat KLT 2x7 cm

- Dimasukkan dalam oven sekitar 10 menit

- Diberi batas dengan pensil batas atas 0,5 cm, batas bawah 1cm

Pelat cincin terkonsentrasi

 Persiapan Eluen
a. Untuk cincin terkonsentrasi

Heksana : Kloroform : Etanol

- Dicampur dengan berbagai perbandingan

- Dimasukkkan dalam vial – vial kecil

Eluen

b. Untuk Penentuan Rf

Kertas saring

- Dicampur dengan berbagai perbandingan

- Dimasukkkan dalam vial – vial kecil

Eluen
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |8

 Tahap Penotolan dan Pengembangan Sampel

a. Untuk cincin terkonsentrasi

Sampel
- Ditotolkan 2-3 kali dengan pipa kapiler pada 6 titik di pelat KLT sampai
warna cukup jelas pada tempat yang sama
- Diberi kode A-F untuk setiap noda
- Diambil campuran pada vial A dengan pipa kapiler
- Ditotolkan pada noda A
- Diperhatikan bentuk cincin yang terjadi
- Dilakukan hal yang sama pada noda B-F
- Ditentukan perbandingan eluen mana yang sesuai dengan sampel

Eluen yang sesuai

b. Untuk penentuan Rf

Pigmen Pandan Betawi

- Ditotolkan pada batas bawah pelat sebanyak 2-3 kali

- Dibuka pelat kaca
- Dimasukkan pelat ke dalam gelas dengan pinset, posisi pelat bagian bawah
menyentuh dasar gelas (tidak miring)
- Jangan sampai noda terkena eluen
- Segera ditutup gelasnya
- Dibiarkan mengembang eluennya hingga menyentuh batas atas
- Diamati noda yang terjadi
- Diberi tanda dengan pensil
- Dikeringkan
- Ditutup dengan selotip
- Dihitung nilai Rf

Nilai Rf
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA |9

PERCOBAAN 3

ANALISIS LIPSTICK DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

A. Tujuan
1. Mampu mengetahui salah satu aplikasi analisis KLT.
2. Mampu melakukan pemisahan senyawa kimia yang terdapat di dalam lipstick dengan
kromatografi lapis tipis.
B. Dasar Teori
Komposisi lipstick terdiri dari lemak, minyak, pewarna dan beberapa senyawa kimia
yang lain. Warna dari lipstick umumnya merupakan unsur aluminium, kalsium, atau barium
dengan kadar 15-20%. Analisis senyawa yang digunakan pada lipstick dapat dipisahkan dengan
kromatografi lapis tipis.
C. Alat
1. Plat KLT
2. Gelas beker
3. Plastic
4. Karet
5. Corong
6. Gelas ukur
7. Pipet ukur
D. Bahan
1. Lipstick
2. N-heksana
3. Kloroform
4. Methanol
5. Akuades
6. Isoamil alcohol
7. Aseton
8. Ammonium hidroksida
E. Langkah Kerja
PREPARASI SAMPEL
1. Siapkan larutan untuk ekstraksi (heksana, kloroform, methanol, dan akuades) masing-
masing sebanyak 2 mL.
2. Masukkan campuran larutan tersebut ke dalam gelas beker.
3. Tambahkan ke dalam gelas beker sedikit lipstick yang telah disediakan.
4. Tutup dengan menggunakan plastic.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 10

5. Campur hingga homogeny dan diamkan kurang lebih 5 menit (larutan sampel siap
dilakukan pengembangan kromatografi).
PENGEMBANGAN KROMATOGRAFI
1. Disiapkan fasa gerak (eluen) yang dibuat dari campuran 7,5 mL isoamil alcohol; 4,5 mL
aseton; dan 3 mL akuades serta 0,75 mL ammonium hidroksida.
2. Eluen dimasukkan ke dalam chamber (gelas beker).
3. Totolkan sampel pada plat KLT.
4. Tentukan Rf masing-masing spot noda

Pengamatan dan Analisis Data

Preparasi sampel = terdapat lapisan minyak dan larutan bening menjadi oranye kemerahan.
Heksana = 2 mL
Kloroform = 2 mL
Methanol = 2 mL
Akuades = 2 mL
Komposisi eluen
Isoamil alcohol (pentanol) = 7,5 mL
Aseton = 4,5 mL
Akuades = 3 mL
NH4OH = 0,75 mL
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 11

PERCOBAAN 4

PEMISAHAN KOMPONEN CAMPURAN SENYAWA BERWARNA DENGAN

KROMATOGRAFI KOLOM

A. Tujuan
1. Mampu mengetahui prinsip analisis dengan kromatografi kolom.
2. Mampu mengetahui teknik analisis dengan kromatografi kolom.

B. Dasar Teori
Kromatografi kolom mekanisme pemisahan yang terjadi pada fase diam dari
kromatografi secara berbeda-beda, tergantung hubungan antara fase diam dan senyawa yang
diuji atau sulut. Kromatografi kolom secara umum dikenal sebagai kromatografi yang
mempunyai fase diam padatan atau solid dan fase gerak cairan, sehingga disebut liquid solid
chromatography. Kromatografi tersebut mempunyai mekanisme pemisahan:
 Adsorbs
 Partisi
 Penukar ion
 Eksklusif
 Afinitas
Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fase
diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan.
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alatnya dapat berupa pipa gelas yang
dilengkapi kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolomnya
tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Meskipun tersedia berbagai macam
kolom gelas namun kadang-kadang buret juga dapat digunakan. Pada praktikum kali ini kolom
yang digunakan yaitu buret, dikarenakan tidak tersedianya kolom yang memadai dilaboratorium.
Metode pemisahan kromatografi kolom memerlukan bahan kimia yang cukup banyak
sebagai fasa diam dan fasa gerak, bergantung pada ukuran dari kolom gelas. Untuk melakukan
pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relative lebih
lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Pada praktikum yang telah
dilakukan ini yang diperlukan untuk memisahkan 7 komponen warna dari warna dasar merah
dan kuning yaitu selama kurang lebih 1 jam. Selain itu hasil pemisahan kurang jelas, artinya
kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu
bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir
fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gravitasi bumi. Ukuran diameter dari partikel yang cukup
besar membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 12

antara komponen –komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter
partikelnya diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka akan menyebabkan
semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa
diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain
karena sukar meregenerasi fasa diam.
Alat kromatografi kolom yang sedrhana terdiri dari kolom dan kaca yang ada krannya
atau bisa menggunakan buret. Fasa diam berupa adsorben yang tidak larut dalam fase gerak
ukuran partikel fasa diam yaitu silica gel harus seragam. Adanya pengotor dalam fasa diam
dapat menyebabkan adsorbansi tidak reversible. Dan juga disiapkan Erlenmeyer yang berfungsi
sebagai penampung eluen.
Sampel yang berupa pewarna tekstil dengan warna merah dan kuning terlebih dahulu
dicampur dan dilarutkan dengan pelarut organic yaitu etanol, karena fase geraknya berupa etanol
dan etanol merupakan pelarut non polar. Kolom yang digunakan adalah buret, dalam
mempersiapkan kolom hal pertama yang dilakukan adalah memasang penahan pada kolom,
penahan yang dipergunakan adalah glass wool dan kapas, hal ini dilakukan karena glas wool dan
kapas memiliki kemampuan menyaring dan menahan penyerap. Proses memasukkan glas wool
kedalam corong pisah dilakukan dengan menggunakan pinset, karena selain dapat menyebabkan
gatal pada tangan, glas wool juga berbahaya jika terhirup. Jumlah glas wool yang ditambahkan
secukupnya dan glas wool yang sudah masuk dalam kolom tidak boleh dipadatkan begitu pula
dengan kapaas.
Penyerap yaitu silica gel dimasukkan dalam kolom kira-kira hingga 7 cm dalam buret.
Proses memasukkan penyerap ini dilakukan dengan menggunakan corong. Selanjutnya
dilakukan proses pencucian sekaligus berfungsi untuk menjenuhkan fasa diam dengan fasa
gerak, hal ini dilakukan agar proses elusi nantinya menjadi lebih cepat. Kemudian dimasukkan
atau ditambahkan kemabli fasa gerak yaitu etanol hingga 1 cm diatas permukaan fasa diam.
Proses penambahan fase gerak dilakukan sebaik mungkin dan homogeny serta hindari
terdapatnya gelembung udara, karena gelembung udara dapat menyebabkan putusnya penyerap
dalam kolom.
Sampel dimasukkan ke dalam kolom dan kran dibuka bersamaan dengan dihidupkannya
stopwatch untuk mengetahui waktu yang diperlukan setiap komponen untuk terelusi sempurna.
Setiap fase gerak sudah hampir 1 cm diatas permukaan fasa diam ditambahkan lagi fasa
geraknya hingga 7 cm. pelarut yang ditambahkan akan turun perlahan kebagian penyerap dan
membentuk pita-pita warna sesuai dengan jenis zat warna yang terkandung dalam contoh.
Pelarut tersebut akan turun dan keluar dengan membawa zat pewarna yang terlarut tersebut.
Pelarut etanol bersifat non polar dan fasa diamnya yaitu silica gel bersifat polar. Senyawa
atau sampel yang bersifat polar akan tertarik pada fasa diam polar melalui ikatan hydrogen atau
tarikan dipol-dipol. Akibatnya senyawa bergerak sangat lambat. Sedangkan senyawa-senyawa
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 13

non polar akan keluar dari kolom pertama kali karena senyawa senyawa ini bergerak lebih cepat
disbanding senyawa polar karena mengikuti fasa geraknya yang bersifat non polar. Biasanya
proses kromatografi diawali dengan pelarut kurang polar terlebih dahulu untuk mengeluarkan
senyawa-senyawa non polar, kemudian disusul dengan pelarupelarut lebih polar untuk
memisahkan dan mendorong senyawa-senyawa polar.
C. Alat
1. Kolom yang terbuat dari kaca
2. Kapas atau glasswool
3. Tabung
D. Bahan
1. Silica gel
2. Kloroform dan etanol atau eter dan aseton
3. Analit (senyawa berwarna)
4. Pasir laut
E. Langkah Kerja
Penyiapan Kolom dan Fase Diam
1. Siapkan kolom untuk kromatografi, masukkan kapas atau glasswool pada bagian kolom
dan kran kolom ditutup.
2. Tambahkan pasir laut 1-2 cm
3. Tuangkan cairan fase gerak/pelarut sampai setengah bagian kolom, masukkan fase diam
yang akan digunakan sampai jumlah yang dikehendaki atau campur keduanya terlebih
dahulu baru dimasukkan ke dalam kolom.
4. Keluarkan cairan fase gerak sampai 1 cm diatas permukaan fase diam. Amati dengan
baik. Perhatikan jangan sampai ada gelembung udara dalam fase diam. Kolom siap
digunakan.
5. Masukkan sampel ysng telah dicampur pelarut
6. Secara perlahan buka kran kolom sehingga eluen akan mengalir keluar.
7. Catat waktu pertama setelah penetesan fase gerak.
8. Fraksi yang keluar ditampung tiap 5 mL, catat pada menit beberapa tetesan atau fraksi
yang berisi analit pertama mulai keluar (menit pertama dan terakhir untuk suatu analit
yang sama).
9. Demikian seterusnya untuk analit berikutnya.
10. Perhatian: penambahan fase gerak jangan sampai terlambat yaitu jangan sampai
cairan fase gerak diatas fase diam habis.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 14

PERCOBAAN 5

PEMISAHKAN SENYAWA YANG TERKANDUNG PADA EKSTRAK DAUN JAMBU

BIJI (PSIDIUM GUAJAVA L.) DENGAN METODE KROMATOGRAFI KOLOM

A. Tujuan
Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak daun jambu biji
(Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi kolom berdasarkan tingkat
kepolarannya.
B. Alat
kolom, statif, botol vial, botol coklat, gelas ukur, dan pipet tetes.
C. Bahan
Bahan yang digunakan ekstrak jambu biji yang tidak larut heksan (non polar), kapas, silica,
n-heksan, etil asetat dan kapas.
D. Langkah Kerja
1. Masukkan glass wool/ kapas dan pasir laut ke dalam kolom
2. Ditimbang silika sebanyak 100 gram. Silika kemudian disuspensikan dengan n-heksan,
lalu dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding sembari dimampatkan agar tidak ada
gelembung udara dan keran kolom dibuka.
3. Kemudian dimasukkan silika yang sebelumnya telah disuspensikan dengan n-heksan dan
dimampatkan
4. Setelah silika mencapai dua per tiga dari tinggi kolom
5. Dimasukkan sampel sebanyak 1 gram ekstrak daun jambu biji (bercampur pelarut)
6. Dimasukkan gradient konsentrasi eluen dari yang paling non polar hingga paling polar
Eluen yang digunakan adalah heksan:etil asetat = 10:1, heksan:etil = 8:1, heksan:etil
asetat = 6:1, heksan:etil asetat = 4:1, heksan:etil asetat = 1:3, heksan:etil asetat = 1:4,
heksan:etil asetat = 1:6, heksan:etil asetat = 1:8, heksan:etil asetat = 1:10, dan etil asetat
100% masing-masing sebanyak 50 ml.
7. Ditampung hasil dalam botol vial
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 15

E. Keterangan

Elusi yang dilakukan pada kromatografi kolom dilakukan dari eluen non polar ke eluen polar,
agar pemisahan yang terjadi dapat menghasilkan pemisahan senyawa yang baik, dimana ketika
eluen polar yang terlebih dahulu dilewatkan, maka senyawa yang sifatnya polar maupun non
polar akan ikut terelusi, karena kemampuan yang dimiliki oleh pelarut polar dapat melarutkan
senyawa yang sifatnya polar dan non polar sehingga pemisahan tidak terjadi, berbeda ketika
eluen non polar yang dilewatkan terlebih dahulu, kemampuan eluen non polar hanya dapat
melarutkan/mengelusi senyawa non polar. Hasil partisi yang tertampung adalah 10-20 vial
dengan berbagai variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 16

PERCOBAAN 6

PEMISAHAN SENYAWA DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

A. Tujuan
1. Mendeskripsikan prinsip keja kromatografi kolom.
2. Memisahkan senyawa dengan metode kromatografi kolom
B. Dasar Teori
Pemisahan Kromatografi, Menurut Underwood (2002:224), Pemisahan kromatografi kolom
adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-
beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom terabsorpsi termasuk pada cara
pemisahan cair padat, substrat padat bertindak sebagai fasa diam yang sifafnya tidak larut dalam
fasa cair, fasa bergeraknya adalah cairan atau pelarut yang mengalir membawa komponen
campuran sepanjang kolom. Pemisahan bergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada
bidang antar muka diantara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif
komponen pada fasa bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi
kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis.
Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali
pada fasa bergerak.
Ada beberapa keuntungan dalam kromatografi, Menurut Alimin (2007:116), keuntungan
pemisahan dengan metode kromatografi adalah
a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal
dan rumit.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah
kapasitas yang mamadai untuk menerima sampel-sampel tanpa melamapaui fasa diamnya.
Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang-kurangnya sepuluh
kali ukuran diameternya. Bahan pengemasnya, suatu adsorsben seperti alumina atau mungkin
suatu resin pertukaran ion, dimasukkan dalam bentuk suspense ke dalam porsi fasa bergerak dan
dibiarkan diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada di atas
permukaannya. Keran dibuka, dan permukaan cairan dibiarkan turun sampai mencapai puncak
permukaan hamparan kemudian porsi kecil dari larutan sampel dipipet dengan hati-hati ke atas
puncak permukaan hamparan. Larutan efluen keluaran dikumpulkan dalam sederatan fraksi
volume yang tidak merepotkan. Larutan tersebut dapat menetes jatuh ke dalam sebuah gelas
beker atau tabung uji tiap kali telah terkumpul sejumlah volume tertentu.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 17

C. Alat
No. Nama Alat Ukuran Jumlah Gambar
1. Gelas kimia 250 mL -

2. Gelas ukur 50 mL -

3. Batang statif - -

4. Erlenmeyer 250 mL -

D. Bahan
No. Nama Bahan Ukuran Jumlah Gambar

1. Aluminum oksida 20 gram -

M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 18

No. Nama Bahan Ukuran Jumlah Gambar

2. KMnO4 5 mL -

3. K2Cr2O7 5 mL -

4. 1-Butanol 20 mL -

E. Prosedur Kerja
No. Prosedur Kerja Hasil Pengamatan Reaksi Perhitungan
1. Didalam kolom -
kromatografi yang telah di
bersihkan dimasukkan
penjerap aliminium oksida
yang dibasahi dengan air
setinggi 10 cm.
M o d u l A n a l i s i s I n s t r u m e n – X I I KA | 19

No. Prosedur Kerja Hasil Pengamatan Reaksi Perhitungan

2. Melalui corong ditambah -
pelarut 1-butanol hingga
mencapai 1 cm diatas
permukaan penjerap,
dimasukkan slika gel dan n-
heksana sebanyak 20 ml.

3. Dimasukkan 1 mL sampel
KMnO4 dan K2Cr2O7 yang KMnO4 + KCrO7 
telah dicampurkan, Mn 2+ + CrO4
kemudian dibuka keran
kolom nya dan di biarkan
cairan dalam kolom akan
turun membawa komponen-
komponen campurannya.
4. Proses ini di teruskan -
hingga didapat semua
komponen keluar dari
kolom dan di tampung di
tempat yang berbeda,
hingga di dapat 3 fraksi.
Disiapkan gelas kimi
dibawah kran. Waktu yang
dibutuhkan untuk keluar
eluennya beberapa jam, lalu
setelah eluennya keluar, di
pisahkan dengan dua gelas
kimia yang berbeda.