STANDAR OPERASIONAL PROSEDUR

Prodi D3 Farmasi Analisa kadar obat menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
FMIPA UNIB

No. Dokumen No. Revisi Halaman

…………………… ………………… …………………
ProsedurTetap Kimia Farmasi II Ditetapkan
Ka. Prodi D3 Farmasi

Tanggal Terbit
……………2021 (Nori Wirahmi, M. Farm. Apt)
Pendahuluan Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara
dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).
HPLC (High-performance liquid chromatography) atau KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). sebuah teknik analisis untuk
identifikasi zat/senyawa dan memisahkan serta mengukur jumlahnya dalam
suatu larutan campuran. HPLC dapat digunakan untuk analisa Kualitatif
dan analisa Kuantitatif:
1. Analisa Kualitatif (digunakan untuk mengidentifikasi senyawa):
dengan membandingkan waktu retensi senyawa yang diuji
dengan standar. Waktu retensi umumnya konstan dalam setiap
kondisi kromatografi yang sama. (Ri st = tRi / tRst )
2. Analisa Kualitatif (digunakan untuk menghitung konsentrasi
atau kadar senyawa): dengan menganalisa luas puncak
kromatogram dan membandingkannya dengan standar baku
murni atau kurva kalibrasi. (syarat R ≥ 1,5),

ada 2 metode
a. Baku luar ( dengan kurva kalibrasi)
 Buat kurva kalibrasi antara luas puncak dengan konsentrasi
dengan persamaan y = a + bx, syarat nilai r ≥ 0,99
Kekurangan metode ini diperlukan baku yang murni serta
ketelitian dalam pengenceran dan penimbangan
b. Baku dalam (perbandingan luas puncak)
Sejumlah baku dalam ditambahkan pada sampel danstandar,
kemudian campuran disuntikkan dan hitung perbandingan
As
luas puncaknya (Cs = x Cst ).
𝐴��
Kesulitan cara ini adalah diperlukan baku dalam yang tepat.

HPLC diindustri farmasi digunakan untuk menguji kadar bahan baku,

bahan antara maupun produk jadi.
Kelebihan HPLC dibandingkan instrument lain:
1. Waktu analisis yang cepat kurang dari 30 menit
2. Daya pisahnya baik
3. Peka
4. Banyak pilihan komlom dan eluen serta kolom dapat dipakai
kembali.
5. Dapat digunakan untuk molekul besar dan kecil
6. Mudah untuk memperoleh kembali cuplikan
7. Dapat menghitung sampel sampai kadar yang sangat rendah (ppt)
Pemahaman Instrumentasi:

Gambar 1. Skema alat HPLC

Cara kerja alat HPLC:
1. Zat pelarut atau yang dikenal dengan istilah solvent akan disimpan
pada solvent organizer dan terhubung dengan inlet maupun outlet
dari modul lainnya, begitu pula dengan sample yang terhubung
dengan auto sampler.
2. Module pompa akan memberikan tekanan yang besar (berkisar
antara 6000-9000psi) untuk mendistribusikan solvent maupun
sample dengan tekanan yang tinggi ke module-module lainnya.
Selama proses recording base line, sample belum dimasukan
kedalam solvent, namun ketika base line dirasa sudah stabil maka
auto sampler mulai menjalankan algoritma injeksi sample.
3. Column oven akan mengkondisikan suhu supaya temperatur
solvent maupun sample berada pada range yang sesuai. Di lain
module, detector UV-Vis melakukan recording ketika base line
maupun ketika sample sudah injeksikan dan melewati kolom.
Berbagai pengaturan maupun setting pada instrument HPLC
biasanya dikendalikan oleh pengguna melewati software. Output
dari hasil pemeriksaan yang ditangkap oleh detector akan
ditampilkan dalam bentuk grafik di komputer.
Bagian Bagian HPLC:
1. solvent organizer pada HPLC umumnya digunakan untuk
menghilangkan pengaruh gelembung (gas) atau mengurangi
fluktuasi tekanan yang menyebabkan base line conditioning tidak
bisa tercapai.
2. Pompa HPLC fungsinya untuk mendorong fase gerak masuk ke
dalam kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible.
umumnya beberapa pompa memiliki tekanan yang berkisar pada
6000psi.
3. Auto Sampler Fungsi bisa mengurangi akumulasi sample yang
terlalu banyak dan menghindari kontaminasi dari luar, terlebih jika
memiliki banyak sample yang akan dianalisa. Presisi injeksi yang
tinggi diperlukan dalam proses auto sampler. Pada tipe konfigurasi
isocratic injeksinya manual.
4. Column Oven pada HPLC berfungsi untuk menjaga suhu atau
temperature pada range tertentu. Kolom dianggap sebagai jantung
pada kromatografi yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/ analit.
Fase dalam HPLC ada dua jenis, yakni: Normal dan Terbalik
 Pada fase normal yang menjadi fase diam adalah kolom yang
bersifat polar, sedangkan fase geraknya non polar. Sedangkan pada
fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar dan fase geraknya
polar.
5. Detector fungsinya berfungsi untuk mendeteksi keberadaan
komponen yang telah melewati kolom dan memberikan sinyal
elektronik pada pengolah data. Detektor yang paling banyak
digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah
detektor spektrofotometer UV 254 nm.
6. Waste adalah tempat pembuangan eluen yang sudah melewati
detektor.
7. Recorder adalah menampilkan hasil yang diperoleh pada hasil
analisis yang ditampilkan melalui komputer dalam bentuk
kromatogram.
Tujuan Menentukan kadar suatu zat dalam sampel (obat) dengan menggunakan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Langkah Kerja A. Persiapan Awal Sebelum Menggunakan HPLC
Berikut ini tahapan awal yang perlu dilakukan, sebelum menggunakan
HPLC :
1. Lakukan persiapan sample yang yang akan dianalisa dengan
menggunakan instrument ini, pastikan jumlahnya sesuai dan anda
mengerti metode apa yang perlu digunakan.
2. Lakukan pengecekan kabel ke sumber daya(listrik). Pastikan
setiap kabel sudah terhubung, baik komputer ke listrik, instrumen
ke listrik atau komputer ke instrumen.
3. Jika dirasa tegangan listrik di wilayah anda tidak stabil, disarankan
menggunakan stabilizer untuk memastikan sumber daya stabil.
4. Nyalakan komputer dan setiap modul pada alat HPLC. Perhatikan
sejenak setiap modul dan komputer, apakah menyala dengan baik.
Jika terdapat modul yang tidak menyala atau komputer tidak
menyala, lakukan pengecekan kabel yang terhubung ke sumber
daya.
5. Saat anda merasa sudah menyalakan instrument sesuai prosedur,
namun tidak menyala. Tidak perlu menekan tombol power
berulang kali, hubungi saja teknisi laboratorium anda.
6. Buka atau double click icon software yang HPLC di komputer
anda. Lakukan pengecekan sederhana, apakah instrument dan
komputer sudah saling terhubung dan bisa berkomunikasi. Pada
 beberapa kasus, jika instrument sudah terhubung dengan komputer
ditandai dengan bunyi beep pada instrument.

B. Pengoperasian HPLC Dengan Sample

Perlu diketahui di awal, penggunaan HPLC dengan konfigurasi
manual injector dan auto sampler memiliki sedikit perbedaan, namun
masih dalam alur yang sama. Berikut ini adalah tahapan cara
mengguna HPLC secara global :
1. Perhatikan pipa atau selang outlet sudah terletak pada penampung
yang benar. karena ini penting untuk menampung limbah proses
analisa.
2. Fokus ke software yang ada di komputer. Sebelum dan setelah
menggunakan alat laboratorium ini, anda diharapkan melakukan
flush atau purge atau dikenal dengan istilah pencucian kolom. Hal
ini dilakukan agak kondisi kolom selalu dalam keadaan bersih dan
tidak tersumbat. Pastikan membuka katup tekanan sebelum
melakukan pembersihan kolom.
3. Perhatikan dan pastikan larutan yang digunakan untuk fase gerak
tersedia dalam jumlah yang cukup. Beberapa jenis larutan yang
digunakan diantaranya adalah : Asetonitril, Metanol atau
Aquabidest.
4. Lakukan setting method pada software HPLC. Pada tahap ini anda
diminta untuk melakukan setting detail mengenai aplikasi,
komposisi dan waktu injeksi. Jika sebelumnya anda sudah
memiliki method, tidak perlu membuat baru, gunakan saja yang
sudah ada.
5. Operasikan instrument untuk mendapatkan base line yang stabil.
Jika belum mendapatkan base line yang stabil, perhatikan langkah-
langkah sebelumnya. Jika diantara anda ada yang masih pemula,
mintalah seseorang yang lebih ahli untuk membantu dalam hal ini.
6. Pastikan tidak terdapat gelembung pada cairan fase gerak. Salah
satu hal yang membuat base line menjadi tidak stabil adalah
adanya gelembung. Beberapa jenis HPLC biasanya dilengkapi
dengan degasser.
7. Setelah base line didapat, anda bisa mulai memasukan sample.
Dengan cara injeksi manual atau auto sampler, itu tergantung
konfigurasi dari alat anda. Kelebihan menggunakan auto sampler
tentunya lebih otomatis dan presisi.
 8. Detektor akan menangkap data dari sample dan menampilkannya
di software. Pada beberapa kasus mungkin saja anda menemukan
puncak ganda, dan belum langsung menemukan puncak tunggal
pada chromatogram. Lakukan optimasi jika diperlukan.
9. Save atau print hasil pengukuran.

C. Tahapan Setelah Penggunaan HPLC

Beberapa hal yang perlu anda perhatikan setelah menggunakan alat
laboratoriu ini adalah :
1. Keluarkan vial dari auto sampler
2. Lakukan flush atau membersihkan kolom.
3. Mematikan instrument sesuai dengan alur yang ditetapkan. Jika
perlu melakukan disconnecting instrument, lakukan itu terlebih
dahulu sebelum menonaktifkan switch power.
4. Matikan komputer dan cabut sumber daya, jika tidak digunakan
dalam waktu lama.
5. Tutup HPLC dengan cover atau case lainnya untuk mencegah
debu dan kotoran menempel.
Alat dan Bahan Alat:
Alat yang digunakan pada percobaan ini alat gelas standar lab., dan HPLC
RIGOL L-3000
Bahan:
Bahan yang digunakan adalah fase gerak metanol, aquadest, baku
parasetamol, dan panadol.
Prosedur Kerja Contoh sampel yang digunakan Parasetamol
1. Ditimbang 120 mg sampel yang mengandung parasetamol dimasukkan
kedalam labu ukur 100 ml dilarutkan dengan air kemudian dicukupkan
volumenya hingga batas, kocok homogen.
2. Saring dan dibuang 20 ml filtrat pertama. Filtrat sisa ditampung.
3. Pipet 10 ml larutan diataskemudian dimasukkan ke labu ukur 100 ml
cukupkan volumenya hingga batas.
4. Suntikkan sebanyak 20 µL larutan akhir pada alat HPLC
Perhitungan Kromatogram memberikan tR = 6’ dan luas puncak 28.000 µV/s
1. Berapakah kadar parasetamol dalam sampel tersebut jika larutan
standar parasetamol dengan konsentrasi 10 ppm disunttikkan pada
alat HPLC sebanyak 20 µL menghasilkan luas puncak 32.000 µV/s
2. Berapakah kadar parasetamol dalam sampel tersebut jika diketahui
data kurva kalibrasi dibawah ini

Konsentrasi (ppm) Luas Puncak (µV/s)

2 6100
4 12500
6 18600
8 25000
10 32200
12 37000

Jawab:
Sampel: 120 mg → dalam labu 100 ml
120 mg 120 x 1000 µg
= = 1200 ppm
100 ml 100 ml

Pipet 10 ml masukkan ke dalam labu ukur 100 ml

120 0 µg x 10
100 ml
= 120 ppm

Dik :
larutan standar parasetamol konsentrasi 10 ppm → luas puncak 32000 µV/s
Dit: Kadar sampel ?
L u as punca k st anda r ko nsent rasi stna da r
=
Luas puncak sampel
konsentrasi sampel
32000 µV /s 10
ppm =
28.000 µV/s C sampel

Konsentrasi sampel = 8,75 ppm

8 , 75 𝑝𝑝𝑚
Kadar sampel = 120 ppm
x 100% =7,2916 %

b. Berapakah kadar parasetamol dalam sampel tersebut jika diketahui data

kurv kalibrasi dibawah ini:

Tentukan persamaan garis y = a + bx ; dan koefesien relasi (r)

Dari data kurva kalibrasi didapat persamaan garis y = -99,9999 +
3142,857X Diamana: a = -99,9999
b = 3142,857
 r = 0,9992
Luas puncak sampel = 28.000 µV/s, maka:
y = -99,9999 + 3142,857X
X = 8,9409 ppm
Kadar sampel =
8 , 9 409 𝑝𝑝𝑚
Kadar sampel = x 100% =7,45%
120 ppm

Kesimpulan Jadi kadar parasetamol tersebut adalah:

1. Dengan menggunakan metode baku dalam adalah 7,2916 %
2. Dengan menggunakan metode baku luar adalah 7,45%
Sumber Rujukan Ghalib, Ibnu Ganjar Dan Abdul Rahman. 2007. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Belajar
Panitia Farmakope Indonesia. 1979. Farmakope Indonesia Ed.3. Jakarta:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Panitia Farmakope Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Ed.4. Jakarta:
Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
R.A.Day, Dr Jan Dan Al - Underwood. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif.
Jakarta: Erlangga
Sumar, Hendayana. 1994. Kimia Analisis Farmasi. Jakarta: UI Press

https://farmasiindustri.com/industri/prinsip -dan-cara-kerja-hplc.html,
diakses 20 Juni 2021

https://andarupm.co.id/hplc/, diakses 20 Juni 2021

Istilah:
1. tR = retention time = waktu yang diperlukan sebuah komponen sampel untuk melintasi kolom sepanjang L
2. R = Resolusi = merupakan ukuran apakah suatu senyawa terpisah secara baik atau tidak dengan senyawa lain syarat

≥1,5
 LEMBAR OBSERVASI

Nama Mahasiswa :
NIM :
Kompetensi : Analisa kadar obat menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Penguji melakukan penilaian dengan memberi tanda ( √ ) pada checklist dari skala berikut.
Skala
Penilaian Ket.
No Elemen Kriteria Pencapaian Kompetensi
0 1 2

1. Pendahuluan 1.1 Mengetahui bagian septrofotometri UV-Vis

2. Persiapan 2.1 Mengetahui cara kerja alat
2.2 Mengetahui cara menggunakan alat
3. Alat dan bahan 3.1 Dapat menyebutkan alat dan bahan yang dipakai
serta kegunaannya dalam percobaan.
4. Prosedur kerja 4.1 Mengetahui prosedur kerja percobaan.
5. Kesimpulan 5.1 Mampu melakukan perhitungan dalam percobaan
5.2 Mampu menarik kesimpulan dari hasil percobaan.
Total Score

Ket : Bengkulu, …………….. 2021

0 = tidak kompeten (tidak menjawab) Penguji
1 = perlu bimbingan (menjawab tidak lengkap)
2 = kompeten (jawaban lengkap)
Ju m la h Sc ore
Nilai= 𝑥 100 (……………………………)
14
 DAFTAR TILIK
KIMIA FARMASI II
Analisa kadar obat menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Nama Mahasiswa :
Stase :

NO KRITERIA PENCAPAIAN SKORE

KOMPETENSI 0 1 2
1. Mengetahui bagian alat HPLC
Mengetahui perhitungan kadar sampel
2.
dengan HPLC

Nilai :
Total Score X 100 Observer
4

( )
keterangan ;
Skore 0 = jawaban salah
Skore 1 = Jawaban benar kurang lengkap
Skore 2 = jawaban benar dan lengkap
 SOAL OSCE

1. Sebutkan bagian alat HPLC dan fungsinya masing-masing

2. Hitung kadar parasetamol yang dianalisa dengan HPLC, jika
Ditimbang 120 mg sampel yang mengandung parasetamol dimasukkan kedalam labu
ukur 100 ml dilarutkan dengan air kemudian dicukupkan volumenya hingga batas, kocok
homogen. Saring dan dibuang 20 ml filtrat pertama. Filtrat sisa ditampung. Pipet 10 ml
larutan diataskemudian dimasukkan ke labu ukur 100 ml cukupkan volumenya hingga
batas. Suntikkan sebanyak 20 µL larutan akhir pada alat HPLC.
Kromatogram memberikan tR = 6’ dan luas puncak 28.000 µV/s

1) Berapakah kadar parasetamol dalam sampel tersebut jika larutan standar parasetamol
dengan konsentrasi 20 ppm disunttikkan pada alat HPLC sebanyak 20 µL menghasilkan
luas puncak 34.500 µV/s
2) Berapakah kadar parasetamol dalam sampel tersebut jika diketahui data kurva kalibrasi
dibawah ini

Konsentrasi (ppm) Luas Puncak (µV/s)

2 7100
4 13000
6 20600
8 28000
10 35200
12 39000