Praktikum 2

PENGENALAN KEPADA INSTRUMEN HPLC

2.1. Pendahuluan
Kromatografi merupakan teknik pemisahan komponen dalam suatu sample. Berdasarkan jenis
fase geraknya, terdapat dua jenis kromatografi yaitu kromatografi cair dan kromatografi gas.
Liquid chromatography merupakan teknik pemisahan yang melibatkan injeksi sedikit sampel cair
ke kolom khusus yang berisi fase diam, di mana masing-masing komponen dalam sampel akan bergerak
terbawa dan terpisahkan sepanjang kolom melalui pergerakan cairan. Komponen –komponen ini akan
terpisahkan akibat perbedaan interaksi dengan fase diam dan fase bergerak. Setelah keluar dari kolom,
komponen akan dikumpulkan dan diidentifikasi menggunakan perangkat luar seperti spektrofotometer
yang dapat mengukur secara kuantitatif suatu komponen berdasarkan intensitas warna.

Gambar 2.1. Skema pemisahan komponen dengan menggunakan liquid chromatography

HPLC merupakan singkatan dari High Performance Liquid Chromatography atau dapat juga
disebut sebagai High Pressure Liqid Chromatography. Teknik ini telah dikenalkan sejak lebih dari 30 tahun
yang lalu dan ia merupakan teknik pemisahan yang paling banyak digunakan hingga kini. Teknik
pemisahan dengan HPLC melibatkan proses injeksi sampel dalam volume yang sangat kecil ke dalam
Penuntun Praktikum AEMGP-2

tabung/kolom berdiameter sangat kecil, yaitu sekitar 3 – 5 µm, yang berisi fase diam (stationary phase).
Masing-masing komponen dalam sampel akan bergerak melalui kolom bersamaan dengan fase gerak
(mobile phase) yang terdorong kuat untuk melewati kolom dengan menggunakan pompa yang bertekanan
tinggi. Komponen-komponen dalam sampel akan terpisah satu sama lain akibat perbedaan sifat

7
interaksinya dengan fase diam dan fase gerak. Komponen-komponen yang terpisah ini akan ditangkap
ketika keluar kolom dan kemudian dideteksi dan diukur jumlahnya melalui suatu perangkat luar yang
disebut detector. Hasil yang ditunjukkan oleh detector ini disebut dengan chomatogram.

Gambar 2.2. Contoh chromatogram

2.2. Perangkat HPLC

Gambar 2.3. Komponen utama HPLC

Secara garis besar terdapat 5 komponen utama HPLC, yaitu: (1) pompa; (2) injector; (3) column;
(4) detector; dan (5) computer. Pompa berfungsi untuk memberikan tekanan pada fase bergerak (fase
bergerak berupa cairan) sehingga fase bergerak bisa mengalir secara konstan pada kecepatan tertentu
Penuntun Praktikum AEMGP-2

(mL/min). Kecepatan normal berkisar antara 1 – 2 mL/min.

Injector berfungsi untuk memasukkan sejumlah kecil sampel yang dianalisa kedalam aliran fase
bergerak. Pada umumnya jumlah sampel yang perlu diinjeksikan adalah sebanyak 5 – 20 µL. Saat ini

8
autosampler dapat digunakan apabila jumlah sampel yang akan dianalisis cukup banyak, sehingga sampel
dapat terinjeksi secara otomatis.

Gambar 2.4. Penampakan HPLC secara utuh

Colomn merupakan inti dari kromatografi. Colomn berisi fase diam yang mampu memisahkan
komponen-komponen dalam sampel menggunakan beberapa parameter karakteristik fisik dan kimia.
Disini juga salah fungsi utama pompa agar tidak sampai terjadi aliran balik di dalam kolom. Mengingat
kolom berdiameter sangat kecil dan berisi fase diam yang sangat padat.
Detector berfungsi mendeteksi masing-masing komponen yang keluar (elute) dari kolom. Detector
juga berfungsi mengukur jumlah komponen yang keluar dari kolom. Grafik yang dihasilkan dari detector
ini disebut dengan chromatogram.
Computer atau sering kali juga disebut sebagai data system. Computer ini tidak hanya berfungsi
untuk mengontrol jalannya HPLC tetapi juga berfungsi untuk menangkap sinyal dari detektor untuk
menentukan waktu retensi (retention time) atau waktu yang diperlukan untuk berelusi dari suatu
komponen yang terpisah untuk mendeteksi jenis komponen serta menghitung jumlah komponen yang
terpisah melalui perbandingan oleh suatu standar. Oleh karena itu, HPLC sangat sesuai untuk analisis
komponen mikro baik secara kualitatif (identifikasi) maupun kuantitatif, terutama untuk komponen yang
bersifat non-volatile (mudah menguap), misalnya: vitamin, produk obat-obatan (aspirin, acetaminophen),
garam (NaCl), protein, komponen organik (polimer), hidrokarbon berantai panjang, bahan-bahan alami
(gingseng, herbal, ekstrak tanaman), komponen yang tidak tahan suhu tinggi (enzim).
Penuntun Praktikum AEMGP-2

9
Prosedur Analisis Kuersetin

Analisis kuersetin dilakukan dengan menggunakan larutan standar yang dibuat dengan
konsentrasi bertingkat (0; 20; 40; 60; 80; dan 100 ppm) yang dilarutkan dengan methanol (HPLC
grade). Filtrat sampel sebanyak 20 μl diinjeksikan ke dalam sistem HPLC menggunakan micro
syringe. Pembacaan kromatogram dilakukan pada kolom C18 dengan panjang gelombang 370
nm dan laju aliran per menit sebesar 1,2 mL dengan durasi per pembacaan selama 5 menit.
Sistem low pressure gradient dengan fase gerak berupa methanol HPLC grade. Kromatogram
sampel yang muncul akan digunakan untuk membuat kurva standar kuersetin.

Contoh bentuk kromatogram standar kuersetin adalah sebagai berikut:

Sumber: Fadilah NR. 2023. Pengaruh Pemberian Puding Okra Ungu (Abelmoschus esculentus L.,
Moench) terhadap Malondialdehida Orang Dewasa dengan Lemak Tubuh Tinggi. Thesis Sekolah
Pascasarjana, IPB, Bogor.