ISOLASI, SELEKSI & IDENTIFIKASI

MIKROBA INDUSTRI
 MIKROBA INDUSTRI

Mikroba  kunci kegagalan atau keberhasilan suatu

fermentasi/kultivasi

Kriteria Mikroba Industri :

• Murni

• Unggul

• Stabil

• Bukan Patogen
Sumber Mikroba

• Sumber mikroba industri : sumber alami atau lembaga koleksi kultur

 Sumber alami : tanah, air, sayuran segar/busuk, tanaman/hewan, limbah
dll  jumlah dan jenis mikroba sangat beragam
 Sumber koleksi kultur : ATCC, CIP, CDDA, FAT

• Tahap pertama dalam seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri
:  isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (semua sel dlm
populasi identik & berasal dari sel induk yang sama  sifat morfologi &
fisiologi seragam).

• Setelah itu dilakukan seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja

terbaik

• Terakhir baru dilakukan identifikasi dengan menggunakan kunci-kunci yang

sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut

• Mikroba yang telah diperoleh harus disimpan dengan teknik penyimpana

yang baik, sehingga kemurniannya terpelihara dalam jangka waktu yang
panjang.
ISOLASI

• Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari

campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah

• Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan

diisolasi dan habitatnya  menentukan sampel apa yang akan
diambil dari alam dan media apa yang akan digunakan

• Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin

(kulkas)

• Teknik Isolasi Kultur Murni :

- 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)
- 2. Penuangan (Pour-plate)
- 3. Kultur Yang Diperkaya
- 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
- 5. Isolasi Sel Tunggal
1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) &
Penyebaran (Spread-plate)

- Paling sesuai untuk bakteri

- Menggunakan agar cawan
- Cara :
Sampel

Pengenceran berseri dg larutan

garam fisiologis (0,85 %)

Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran

(batang gelas) pada media agar , sehingga
koloni tumbuh menyebar

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga

Diperoleh kultur murni

1 sel  1 koloni
• Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri &
menggunakan peralatan yang sederhana
• Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat
digunakan/disebarkan pada media
• Dua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloni
Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak 
pencegahan dengan menambahkan deterjen

2. Teknik Penuangan (Pour-plate)

• Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cair (+/- 450C)

dalam tabung reaksi, sehingga distribusi sampel merata
 dituang ke petri dish & dibiarkan mengeras pada
suhu ruang, lalu diinokulasi
 Teknik Penuangan (Pour-plate)

Sampel +/- 1 g)

1 loop ....
A . .. .. . A
Agar cair
Diperiksa

....
. .. .. . B
B
Koloni terisolasi
Suspensi Pengenceran
Penuangan
Bakteri Dibiarkan mengeras
....
. .. .. . C
C
Inkubasi

Tahap I Tahap II Tahap III

Media agar miring

• Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif
(morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba)

• Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif

dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan
perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan
Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  contoh terlebih dulu
dipanaskan s.d 850C selama 5 menit

• Media Selektif :
- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari
faeces
- Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae

• Media Diferensial :
- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk
koloni berbeda & mudah dikenali
E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik
Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda
3. Kultur Yang Diperkaya

• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis

yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi

tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu
• Cara :

1 2 3 4

Media cair dgn substrat khusus

Contoh : bakteri tanah : α-conidendrin

(+) (-)
Verifikasi
4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

• Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam

jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam susu asam

• Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya

mengandung 1 galur mikroba

• Perlu dicek kemurnian kultur

5. Teknik Isolasi Sel Tunggal

• Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan

mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari
preparat tetes bergantung

• Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan

mikropipet di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel
tunggal ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media
yang sesuai

• Lebih cepat, namun kelemahannya :

- alat mahal
- operator harus trampil
 SELEKSI & IDENTIFIKASI
SELEKSI

Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik

 - rendemen lebih tinggi
- tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak
dikehendaki
- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C dan N
yang murah
- Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang lebih
mudah dipisahkan dari produk

• Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :

1. Mutasi
2. Rekombinasi
• Taksonomi (klasifikasi) :
penataan teratur unit-unit ke dalam kelompok satuan yang lebih besar
 hierarkhi klasifikasi :
spesies  genus  famili  orde  kelas  filum atau divisi

Spesies : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem

klasifikasi organisme

• Nomenklatur :
penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi

• Identifikasi :
penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan nomenklatur
untuk mengidentifikasi mikroba dengan membandingkan dengan ciri-
ciri/ karakteristik yang ada
 Menggunakan kunci-kunci yang sesuai
Contoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology
 Nama menggunakan kombinasi biner Latin, misalnya Rhizopus oryzae
• Contoh identifikasi bakteri :
- tidak terdapat bakteroklorofil
- sel tidak berbentuk filamen
- Gram positif
- berbentuk batang
- menghasilkan endospora
- Katalase positif
- Aerobik
- Nitrit negatif
- VP (Voges Proskauer) negatif
 Bacillus megaterium

Identifikasi Kapang :
 a.l. berdasarkan spora dan miselium

Identifikasi khamir :
 a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula
sebagai sumber karbon
IDENTIFIKASI

• Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi

• Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan
ciri/karakteristik :

1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela,
kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan
pewarnaan maupun tidak

2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu,
cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba

3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam
media, baik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan
koloni, tepi koloni, warna dll)
4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan
mikroba ( kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat
menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll)
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat
5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel,
nukleus, membran dll)
6. Susunan antigen
Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas
* Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi
antibodi saat diinjeksikan ke hewan
7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit
8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA
Probe
Contoh 1. Karakteristik Morfologis
(Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela,
kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan
pewarnaan maupun tidak)

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium
Contoh 3. Karakteristik Kultural
 Tampilan pertumbuhan pada media padat
(bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)
Sel Bakteri
 PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI
• Tujuan :
menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable),
mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi  harus
mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama
diawetkan
Cara :
1. Pemindahan Secara Periodik
- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media agar miring
baru/segar
- Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus
tepat dan disimpan pada suhu dingin (50C)  tidak cocok untuk
penyimpanan jangka panjang

2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral

- Permukaan agar miring atau media cair dilapisi dengan minyak mineral
steril (+/- 0,5 inci)
- Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah minyak
mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dg tetap
mempertahankan kultur awal  tidak cocok untuk penyimpanan jangka
3. Liofilisasi
- Pengeringan beku (freeze-drying)
- Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kultur bakteri
(dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 tahun)

- Cara :
* media berisi senyawa pelindung : eg susu, serum, natrium glutamat
* suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul (vial) kaca
* Perendaman dalam es kering + alkohol (-780C)  beku
* Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum 
kering
* Ampul ditutup dengan melelehkan ampul tsb dlm keadaan vakum
 penyimpanan pada susu lebih rendah dari -50C

- Keuntungan :
* Cocok untuk penyimpanan jangak panjang
* Kemungkinan perubahan kecil
* Wadah penyimpanan kecil
4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah
- Sel dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku (gliserol 10 %
atau dimetil sulfoksida)
- Contoh beku disimpan dalam refrigerator nitrogen cair (suhu
sekitar -150 sampai-1960C)
- Cocok untuk kapang
- Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat
diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini

5. Penyimpanan pada Tanah Steril

- Diterapkan untuk penyimpanan spora bakteri, actinomycetes
dan kapang
- Suspensi 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi
5 g bubuk tanah steril (campuran pasir halus dan tanah liat 1:1)
- Dibiarkan pada suhu kamar selama 10 hari sampai kering
 disimpan pada lemari es