Di alam, populasi mikroorganisme tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran

berbagai macam sel sehingga sulit untuk mengetahui keberadaannya. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme
dalam berbagai habitat (tanah, air, udara, tanaman/hewan, limbah ,dsb) ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi
campuran atau yang biasa dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spesies yang berbeda-beda yang dikenal dengan
istilah biakan murni. Biakan murni ini terdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar,
1986).

Dalam proses pemisahan biakan campuran menjadi biakan murni, mikroorganisme harus diisolasi dari
lingkungannya dan dipelihara pada medium yang sesuai untuk pertumbuhannya. Sehingga diperoleh biakan yang tidak
tercampur dengan jenis lainnya dan dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Akan tetapi,
mikroorganisme adalah makhluk mikroskopis yang tidak bisa dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu, diperlukan
suatu metode kerja untuk dapat membedakan mikroorganisme yang satu dengan yang lainnya dengan cara identifikasi
mikroorganisme, identifikasi membantu mengetahui, mempelajari dan mengklasfikasikan mikroorganisme.
Isolasi Seleksi Identifikasi
 Isolasi ialah proses pengambilan bakteri dari lingkungan asal dan
menumbuhkannya pada media buatan untuk didapatkan biakan murni. Kultur murni didapatkan
dengan memisahkan tiap jenis bakteri yang berasal dari kumpulan berbagai jenis bakteri.
Pemisahan dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri pada media padat sehingga membentuk
suatu koloni bakteri. Koloni yang terbentuk selanjutnya di pindahkan ke media baru secara
terpisah untuk tiap koloni sehingga didapatkan biakan murni (Sutedjo, 1996). Beberapa faktor
yang harus diperhatikan dalam mengisolasi mikroba adalah sebagai berikut :
• Sifat dan jenis mikroba
•Habitat mikroba
•Medium pertumbuhan
•Cara menginokulasi dan inkubasi
•Cara mengidentifikasinya
•Cara pemeliharaannya
1. Menyiapkan sampel
a. Sampel berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu, dll) :
• Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril
• Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril
b. Sampel berupa cairan atau semi cair (air, lumpur, dll) :
• Diambil menggunakan pipet steril
• Penyimpanan bisa menggunakan botol atau tabung polypropylene steril
2. Sampel segera dibawa ke laboratorium (jika jarak jauh, dianjurkan menggunakan es batu atau
tabung polipropilen steril).
3. Sampel harus segera digunakan atau jika tidak, harus disimpan pada suhu dingin (kulkas).
1. Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate)
2. Penuangan (Pour-plate)
3. Kultur yang diperkaya (Enrichment Culture)
4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
5. Isolasi sel tunggal
1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) dan Penyebaran (Spread-plate)

a. Teknik Penggoresan (Streak-plate)

Metode cawan gores/penggoresan merupakan Goresan langsung Goresan radian (untuk
(untuk mengkultur mengkultur mikroba)
suatu teknik isolasi bakteri dengan cara menggoreskan jarum
mikroba)
ose yang telah mengandung kultur bakteri ke permukaan
media padat. Hasil goresan akan membentuk koloni bakteri
setelah masa inkubasi. Koloni yang didapatkan berupa koloni
yang terpisah dengan koloni lainnya atau biakan murni ( 1 sel
= 1 koloni). Berikut cara penggoresan kultur :
1. Goresan langsung
2. Goresan kuadran Goresan kuadran (isolasi koloni
tunggal untuk mempelajari mikroba)
3. Goresan radian
b. Teknik Penyebaran (Spread-plate)

Metode cawan sebar merupakan teknik isolasi

bakteri dengan cara menuangkan kultur mikroba ke media
padat dan menyebarkannya atau meratakannya dengan
menggunakan spreader. Kultur mikroba dilakukan
pengenceran terlebih dahulu agar koloni bakteri yang tumbuh
tidak saling tumpang tindih dengan koloni bakteri lainnya.
Koloni bakteri yang tumbuh dengan menggunakan teknik
isolasi cawan sebar nantinya berada di permukaan media
(dua sel dapat bergabung membentuk 1 koloni). Teknik ini
menggunakan peralatan yang sederhana akan tetapi memiliki
kelemahan yakni, hanya sejumlah kecil sampel yang dapat
digunakan/disebarkan pada media.
2. Teknik Penuangan (Pour-plate)

Metode penuangan merupakan teknik isolasi

bakteri dengan cara menuangkan biakan bakteri ke
dalam media agar yang masih dalam keadaan cair pada
temperature 45oC kemudian dihomogenkan agar biakan
menyebar rata pada media, lalu dituang ke cawan petri
dan dibiarkan mengeras pada suhu ruang,. Koloni
bakteri akan terlihat menyebar rata pada media setelah
masa inkubasi.
3. Kultur yang diperkaya (Enrichment Culture)

• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis

yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi

tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu.
4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

• Digunakan jika mikroba dalam kultur campuran

terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba
lain.
Contoh : S. lactis (Lactococcus lactis) dalam susu
asam
• Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya
mengandung 1 galur mikroba.
• Perlu dicek kemurnian kultur .
5. Teknik Isolasi Sel Tunggal

a. Metode Mikromanipulator
• Menggunakan alat mikromanipulator yang digabung dengan
mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari
sampel.
• Dengan mikromanipulator, operator dapat mengontrol
gerakan mikropipet (tabung kapiler) di bawah lensa obyek,
sehingga dapat diambil sel tunggal& dipindahkan ke dalam
tabung dan selanjutnya dipindahkan ke mediayang sesuai.
• Keuntungan: Lebih cepat
• Kelemahannya : Alat mahal dan operator harus terampil
b. Metode Kapiler
Beberapa tetes media yang mengandung mikroba, ditempatkan pada penutup gelas
obyek steril menggunakan pipet kapiler steril. Dengan menggunakan mikroskop, mencari
tetesan yang mengandung hanya 1 mikroba. Tetesan tersebut dipindahkan dengan pipet
kapiler steril ke media segar mikroba tunggal yang berada pada tetesan mulai
berbiak untuk menghasilkan kultur murni.
 Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni perlu dilakukan
pengujian dengan kriteria sebagai berikut :
1. Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil pewarnaan yang
sama.
2. Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan kesamaan.
3. Hasil penggoresan seragam.
4. Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan/karakteristik identik, contoh
memfermentasi gula yang sama.
• Tujuan :

1.Mendapatkan galur dengan kinerja terbaik

2.Tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak dikehendaki.
3.Morfologi sel menjadi bentuk yang lebih mudah dipisahkan dari
produk.
• Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :
1. Mutasi
2. Rekombinasi
Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik :
1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan
bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan
untuk pertumbuhan mikroba.
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik cair maupun padat
(bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna, dll)
4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba contohnya, kemampuan mikroba
untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas, dll.
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat memfermentasi laktosa.
5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran, dll).
6. Susunan Antigen (Serologi)
Penelaahan sifat antigen–antibodi yang khas
•Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan.
7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit.
8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe.
Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium
Sel Bakteri
(Bentuk Koloni)

(Tepi Koloni)

(Ujung Koloni)

Kultur Pada Agar Miring

• Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah
terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi (harus mampu melestarikan karakteristik
spesies mikroba selama diawetkan)
• Cara :
1. Pemindahan secara periodik
2. Pelapisan kultur dengan minyak mineral
3. Liofilisasi
4. Penyimpanan pada suhu sangat rendah (Cyopreservation)
5. Penyimpanan pada tanah steril
Pelczar, M.J., and E.C.S. Chan. 2008. Dasar-
Susilawati, 2020. “Isolasi dan Identifikasi
Dasar Mikrobiologi I. UI Press,
Bakteri” dalam Academia.
Jakarta.
https://www.academia.edu/374
Wati, 2020. “Isolasi dan Identifikasi Bakteri”
72469/ISOLASI_DAN_IDEN
dalam Uji kemampuan biodegradasi
TIFIKASI_BAKTERI
sampah plastik polyethylene (PE)
(Diakses 18 September 2022)
oleh bakteri pendegradasi plastik yang
Sutedjo, M.M. 1996. Mikrobiologi Tanah.
diisolasi dari Tempat Pembuangan
PT Rineka Cipta, Jakarta.
Akhir (TPA) Jabon Sidoarjo,
Universitas Islam Negeri Sunan
Ampel : Surabaya.