LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK ISOLASI MIKROORGANISME

Disusun oleh :
Zahratush Shalehah ( 4401420003 )
Rombel Pendidikan Biologi B1 2020

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2021
A. TUJUAN
1) mempelajari berbagai cara mengisolasi mikroba dengan berbagai metode
2) Melatih praktikan untuk dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga di dapat
kultur murni
3) Melatih praktikan mendapatkan hasil isolasi bakteri dengan keadaan yang berbeda
4) Melatih praktikan mampu melakukan pengenceran bertingkat, inokulasi bakteri dalam
media padat dan cair

B. DASAR TEORI
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi
bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal
sebagaibiakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam
mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis
mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal
sebagai biakan dua-jenis (Alam dkk, 2013)
Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk perkembangannya, sebab
itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam sebuah tabung percobaan labu atau cawan
Petri. Pada permulaannya tabung atau cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari
setiap mikroorganisme hidup) lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung
atau cawan harus dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama pencemaran dari
luar adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan. Bentuk
cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk mencegah pencemaran
udara (Alam dkk, 2013)
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang
berguna untuk membiakkan mikroba. Agar mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media,
maka medium tersebut harus memenuhi syarat-syarat, antara lain: harus mengandung semua
zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan
permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh, tidak
mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam
keadaan steril sebelum digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan
baik (Plezar, 2006).
 Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran
mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah-pisah. Teknik yang
digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya
tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun
membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang.
Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium
agar nutrient dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme
akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri
secara cepat sehingga dalam waktu 18-24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan
dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan
murni satu macam mikroorganisme (Joddi, 2006).
Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolasi dilakukan dengan cara mengambil
sampel mikroba dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian
dikultur/dibiakan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung
tujuan yang ingin dicapai. Untuk mendapatkan atau menumbuhkan jenis mikroorganisme
tertentu, maka dilakukan isolasi. Dengan isolasi inilah dapat diidentifikasi jenis bakteri
tertentu baik dari kelimpahan maupun morfologinya. Isolasi bakteri merupakan suatu cara
untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya sehingga
diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu
sel tunggal. Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk
menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural,
morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu
macam mikroorganisme saja. Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan
diisolasi dan habitatnya menentukan sampel dan media apa yang akan digunakan. Pemilihan
mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa keuntungan bila dibandingkan yang
diisolasi dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah
ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah
ditingkatkan bila dikehendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah,
kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang
dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Torben,2007)
Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan
dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan
serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies (Suriawiria, 2005). Dikenal
 beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua
diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan
tuang, yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies
individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati (Afrianto, 2004).
a. Spread Plate Method (Cara Tebar/Sebar) Teknik spread plate merupakan teknik isolasi
mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan
media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur
mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba pada umumnya tidak diketahui, maka
pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari
pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang
terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.
b. Pour Plate Method (Cara Tabur) Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang
sedang mencair pada temperatur 45-50oC dengan suspensi bahan 31 yang mengandung
mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat
koloni-koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980)
c. Streak Plate Method (Cara Gores) Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni
mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni.
Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas
goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba,
sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk
koloni yang menyebar terutama bila digunakan lempengan yang basah. Untuk mencegah hal
itu harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994)
 C. HASIL PENGAMATAN

No. Nama Gambar Alat, Bahan & Cara Kerja

1 Spread ➢ Alat dan bahan:
Plate 1. Spreader/batang bengkok/batang
Drigalsky
2. Pipet volume, lampu bunsen
3. Media NA dalam cawan petri
4. Kultur murni bakteri
5. Larutan pengencer (BPW atau
NaCl fisiologis 0,9%)

➢ Cara kerja:
1. Buatlah pengenceran 10:1 – 10:6
dari kultur murni bakteri dengan
larutan pengencer.
2. Ambil tabung reaksi yang
mengandung kultur murni
bakteri, buka dan bakar leher
tabung.
3. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri
secara aseptis ke permukaan
media NA dalam cawan petri.
4. Bakar spreader yang sebelumnya
telah dicelupkan dalam alkohol,
biarkan dingin.
5. Tebarkan/sebarkan kultur
bakteri dengan spreader secara
merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering.
6. Setelah permukaan agar
mengering, selanjutnya
inkubasikan secara terbalik
selama 24 jam pada suhu kamar
dan amati pertumbuhannya.
7. Bandingkan pertumbuhan dari
tiap-tiap pengenceran dan
bandingkan pertumbuhannya
dengan hasil teknik spread plate
pada percobaan 2 (sterilisasi
secara filtrasi).
2 Pour Plate ➢ Alat dan bahan :
1. Media NA dalam tabung reaksi
2. Cawan petri steril
3. Kultur murni bakteri
4. Pipet volume, lampu bunsen

➢ Cara kerja :
1. Dinginkan media NA dalam
tabung reaksi sampai suhu ± 45 -
500C (cirinya: terasa hangat di
kulit).
2. Buka tutup tabung yang
mengandung kultur murni
bakteri, dan bakar leher botol.
3. Pindahkan 1 ml kultur murni
bakteri ke dalam tabung reaksi
yang mengandung NA secara
aseptis.
4. Bakar leher tabung di atas
bunsen, dan tuangkan media NA
yang telah mengandung kultur
murni bakteri ke dalam cawan
petri.
5. Goyangkan perlahan-lahan
untuk mencampur kultur bakteri
dengan NA sampai homogen.
Penggoyangan petri jangan
terlalu kuat. Pada saat
penuangan media, petri bisa
diletakkan dalam radius
maksimal 20 cm dari sumber api
(zona steril)
6. Setelah agar memadat diinkubasi
terbalik pada suhu kamar selama
24 jam. Inkubasi terbalik
dilakukan setelah agar memadat.
Amati pertumbuhannya.
3 Streak ➢ Alat dan bahan:
Plate 1. Media NA dalam cawan petri
2. Kultur murni bakteri
3. Jarum ose
4. Lampu bunsen

➢ Cara kerja:
1. Panaskan jarum ose hingga
memijar di atas bunsen,
kemudian dinginkan. Gunakan
ose yang telah dingin untuk
menggores pada permukaan
media agar dalam cawan petri.
2. Ambil 1 ose kultur murni bakteri
dan goreskan pada permukaan
media agar dimulai pada satu
ujung. Ose disentuhkan pada
permukaan media agar dalam
cawan petri, sewaktu menggores
ose dibiarkan meluncur di atas
permukaan agar.
3. Setiap kali menggoreskan ose
untuk kuadran berikutnya,
pijarkan ose terlebih dahulu dan
biarkan dingin.
4. Inkubasikan secara terbalik pada
suhu kamar selama 24 jam dan
amati pertumbuhannya.
4 Direct Plate Percobaan menggunakan NA ➢ Alat dan Bahan :
1. Media NA
2. Ranting batang Kayu Manis &
Lengkuas
3. Alkohol 70%
4. Aquades
5. Tempat steril

➢ Cara Kerja :
1. Menyiapkan Media NA yang
sudah padat pada tempat steril
yang akan menjadi tempat
Hasil menggunakan PDA isolasi
2. Potong kecil kayu manis,
celupkan kedalam alkohol 70%
selama 5 menit lalu bilas
menggunakan aquades
3. Dedar potongan kayu manis
kecil diatas media NA lalu
amati perubahan.

Isolat kapang endofit dari ranting kayu

manis yang tumbuh pada media Potato
Dextrose Agar (PDA):
A). Cb.B1; B). Cb.B2; C). Cb.B3; D).
Cb.B4; E). Cb.B5; F). Cb.B6; G). Cb.B7;
H). Cb.B8; I). Cb.B9.
Keterangan: Cb = Cinnamomum burmanni,
B = Ranting batang
D. PEMBAHASAN

Isolasi kapang endofit dari ranting kayu manis menggunakan media PDA dan
didapatkan 9 isolat kapang endofit (Gambar 2). Kapang endofit yang berhasil diisolasi
memiliki deskripsi ciri-ciri dan karakter makroskopis yang bervariasi. Praptiwi et al. (2015)
melaporkan bahwa sebanyak 26 kapang endofit berhasil diisolasi dari beberapa bagian
tanaman kayu manis, 12 isolat kapang berhasil diisolasi dari batang kayu manis, dan 14 isolat
diisolasi dari bagian daun kayu manis. Kapang tersebut 8 isolat diklasifikasikan ke dalam
genus Pestalotiopsis, 3 isolat genus Xylaria, 2 isolat genus Colletotrichum, dan 1 isolat genus
Fusarium. Dua isolat hanya dapat diidentifikasi sampai tingkat famili, yaitu Dematiaceae, dan
10 isolat hanya dapat diidentifikasi sampai tingkat kelas yaitu Coelomycetes. Akan tetapi
tidak ditemukan isolat Ascomycota seperti yang berhasil diisolasi pada penelitian ini.
Perbedaan variasi kapang endofit yang diisolasi dari suatu tanaman sangat ditentukan oleh
banyak faktor terutama faktor lingkungan. Hal ini menunjukkan bahwa mikroba endofit pada
tanaman bervariasi tergantung pada interaksi dengan endofit atau patogen lainnya (Widowati
et al. 2016).
Isolat Cb.B3 diidentifikasi sebagai Neofusicoccum parvum. Berdasarkan hasil ini
dilihat kekerabatannya dengan beberapa spesies kapang dari tanaman hutan yang telah
berhasil dihimpun oleh Lopes et al. (2016) untuk membuat pohon filogenetiknya. N. parvum
merupakan kapang yang bersimbiosis dengan tanaman sebagai endofit atau fitopatogen.
Beberapa spesies Neofusicoccum adalah patogen bagi suatu tanaman, tetapi spesies yang lain
mempunyai hubungan simbiosis mutualistik dengan inangnya. Perubahan mikroba endofit
menjadi fase patogen bisa diakibatkan karena adanya tekanan seperti tekanan kekeringan,
fluktuasi suhu ekstrim, kekurangan nutrisi dan kerusakan mekanis (Slippers dan Wingfield
2007).
Dalam praktikum isolasi bakteri, diperlukan medium yang berisi zat hara untuk
metabolisme sel, sintesis sel dan pertumbuhan sel. Yang digunakan dalam praktikum adalah
medium padat yaitu agar. Media yang digunakan dalam praktikum adalah NA karena yang
akan di biakan adalah bakteri. Metode yang dilakukan antara lain :
1. Metode tuang (pour plate) Metode tuang terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam
hal ini digunakan bakteri dari udara, air sumur, air sungai tanah dan makanan yang sudah
dibuat dalam acara 1 dengan medium NA dalam cawan petri. Akuades dituang ditengah
cawan, lalu diambil 1 ose bakteri dan dicampurkan dengan akuades yang ada ditengah
cawan. Selanjutnya dituangkan media ke dalam cawan petri, media yang digunakan yaitu
NA pada suhu 45oC – 50oC. Cawan ini kemudian diputar untuk mencampur isinya dan
 dibiarkan memadat. Setelah memadat, diinkubasi selama 2 hari dan terlihatlah koloni
yang ada pada media tersebut. Tujannya adalah memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain
sehingga terbentuk menjadi koloni-koloni yang terpisah dalam medium yang padat. Pada
percobaan isolasi bakteri dengan menggunakan teknik pour plate bentuk koloni bakteri
menyebar tidak teratur. Bakteri yang ada pada medium bentuknya tidak beraturan,
ukurannya titik dan ada beberapa yang berukuran kecil. Kenampakan bentuknya datar
atau flat, dan bagian tepi koloni seperti terdapat filamen.
2. Metode goresan (streak plate) Metode goresan terdiri dari penginokulasian biakan murni
dalam hal ini digunakan bakteri dari udara, air sumur, air sungai tanah dan makanan yang
sudah dibuat dalam acara 1 dengan medium NA dalam cawan petri. Medium NA dengan
suhu 45oC – 50oC dituangkan kedalam cawan petri steril dan diratakan selanjutnya
dibiarkan dingin dan memadat. Setelah medium NA padat, ambil 1 ose bakteri pada acara
1 kemudian goreskan pada permukaan agar. Cara menggoreskannya yaitu cawan dibagi
menjadi 4 bagian kemudian goreskan bakteri pada permukaan agar tiga baris yang
menyambung dari cawan kuadran ke1 sampai ke cawan kuadran ke-4. Setelah diinkubasi
selama 2 hari akan terlihat koloni bakteri berkumpul pada goresan-goresan tersebut.
Seharusnya pada kuadran ke-1 terdapat mikroba dalam jumlah yang penuh kemudian
semakin berkurang pada setiap kuadrannya, dan seharusnya pada kuadran ke-4 mampu
diamati koloni mikrobanya. Dikarenakan pada saat penggoresan yang kurang baik, atau
terjadinya kontaminasi sehingga bakteri menyebar ke semua bagian cawan. Bakteri yang
dihasilkan ada bermacam-macam ukuran ada yang besar dan kecil, bentuk koloni bakteri
tidak beraturan, kenampakan bentuk koloni datar dan bagian tepi koloni tidak rata dan
cenderung bergelombang.
3. Agar miring (slant culture) Metode ini mirip dengan metode streak plate, hanya saja
metode slant culture ini (agar miring) media NA disiapkan dalam tabung reaksi dengan
posisi miring. Satu ose bakteri diambil dari acara I dan digoreskan dengan arah zig-zag
dimulai dari bawah tabung. Setelah itu diinkubasi selama 2 X 24 jam untuk melihat
pertumbuhan bakteri. Dalam percobaan yang dilakukan ada pertumbuhan bakteri yang
terlihat di permukaan agar. Bakteri yang tumbuh disekitar goresan berukuran titik dan
kecil. Bakteri yang tumbuh bersifat aerob.
4. Agar tegak (stab culture) Medium NA disiapkan dalam tabung reaksi, kemudian 1 ose
koloni bakteri diambil dari acara I dan ditusukkan dengan menggunakan jarum ose yang
ujungnya runcing. Setelah itu tabung ditutup menggunakan kapas dan plastik dan
diinkubasi selama 2 hari. Setelah 2 hari inkubasi terdapat pertumbuhan mikroba pada agar
ditusukkan sebelumnya. Bakteri yang tumbuh memiliki bentuk seperti gelembung dan
 bakteri yang tumbuh bersifat anaerob. Pada metode stab culture ini teerjadi kontaminasi
dengan mikro organisme lain yang menyebabkan permukaan agar tegak menjadi
berwarna hijau kebiru-biruan.

KESIMPULAN

Adapun kesimpulan dari praktikum yang dilaksanakan :

1. Media diperlukan untuk menumbuhkan mikroorganisme yang akan diisolasi untuk

kemudian dilakukan langkah identifikasi guna menentukan jenis mikroorganisme tersebut.
2. Setiap mikroorganisme membutuhkan media yang berbeda-beda untuk dapat tumbuh
dengan baik.
3. Secara garis besar, media pertumbuhan mikroorganisme dapat dikelompokkan berdasarkan
sifat fisik, komposisi, dan tujuannya.
4. Isolasi kapang endofit menggunakan teknik direct plating tidak cocok dilakukan diluar
laboratorium karena kemungkinan distraksi dan peluang keberhasilan yang kecil.

DAFTAR PUSTAKA
Afrianto, L., 2004, Menghitung Mikroba Pada Bahan Makanan, Cakrawala (Suplemen pikiran
rakyat untuk iptek), Farmasi FMIPA ITB : Bandung.
Buckle. 2007. Mikrobiologi Terapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta
Indriyani, Nur dan Asnani, 2007, Penuntun Praktikum Mikrobiologi Akuatik, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Unhalu : Kendari.
Plezar.2006. Dasar-Dasar-Mikrobiologi. Jakarta : UI Press
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta
Amilius Thalib, Widiawati Y., dan Hamid H., 2004, Uji Efektif Isolasi Bakteri Hasil Isolasi
Mikroba Rumen dengan Media Asetogen sebagai Inhibutor Metanogenesis, JLTV,
Vol. 9 (4).
Dudeja SS, Giri R, Saini R, Suneja-Madan P, Kothe E (2012) Interaction of endophytic
microbes with legumes. J Basic Microbiol 52:248-260. doi: 10.1002/jobm.201100063
Ferry Y (2013) Prospek pengembangan kayu manis (Cinnamomum burmanii L) di Indonesia.
SIRINOV 1:11-20
Fransworth NR (1966) Biological and phytochemical screening of plant. JPharm Sci 55:225-
265. doi: 10.1002/jps.2600550302