TUGAS KIMIA FARMASI ANALISIS 2 PERTEMUAN MINGGU KE-10

PAPER ANALISIS KROMATOGRAFI

Dosen Pengampu :
Ashfar Kurnia, M.Farm

Disusun oleh :
Sabrina Aisyah Putri (26718419)

Kelas :
Farmasi 2FA01

PROGRAM STUDI S-1 FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN DAN FARMASI
UNIVERSITAS GUNADARMA
DEPOK
2020

i
 KATA PENGANTAR

Dengan menyebut nama Allah SWT yang Maha Pengasih lagi Maha Panyayang, Kami
panjatkan puja dan puji syukur atas kehadirat-Nya, yang telah melimpahkan rahmat, hidayah,
dan inayah-Nya kepada kami, sehingga kami dapat menyelesaikan makalah ini tentang “Metode
Analisis Kromatografi”
Makalah ilmiah ini telah kami susun dengan maksimal dan mendapatkan bantuan dari
berbagai pihak sehingga dapat memperlancar pembuatan makalah ini. Untuk itu kami
menyampaikan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah berkontribusi dalam
pembuatan makalah ini.

Terlepas dari semua itu, Kami menyadari sepenuhnya bahwa masih ada kekurangan baik
dari segi susunan kalimat maupun tata bahasanya. Oleh karena itu dengan tangan terbuka kami
menerima segala saran dan kritik dari pembaca agar kami dapat memperbaiki makalah ini.

Depok,20 Mei Mei 2020

Penyusun

ii
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .............................................................................................. i

DAFTAR ISI............................................................................................................. ii

BAB 1 PENDAHULUAN ........................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ..................................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................................... 2
1.3 Tujuan ................................................................................................................. 2

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 2

2.1 Tinjauan Umum Kromatografi ............................................................................ 2

2.2 Jenis-jenis Kromatografi ...................................................................................... 2
2.3 Validadi dengan Menggunakan Metode Kromatografi ....................................... 9

BAB 3 PENUTUP .................................................................................................... 14

3.1 Kesimpulan .......................................................................................................... 14

DAFTAR PUSTAKA

iii
 1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi sangat penting,terutama
dalam bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang lainnya. Suatu analisis kimia seperti
pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang
dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran banyak
dilakukan. Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya,
akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Tanpa teknik
kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat sukar, dan dalam
banyak kasus, hampir tidak mungkin. Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi
dan dapat di ukur kadarnya, perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karna itu, pemisahan
merupakan langkah penting dalam analisi kualitatis. Suatu analisis kimia menjadi
meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur.
Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa
yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran.

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena

pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.
Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan
kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa
sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik
kromatografi.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang di atas maka dapat diambil rumusan masalah yaitu :
1.2.1 Bagaimana prinsip dari kromatografi?
1.2.2 Apa saja jenis-jenis kromatografi berdasarkan penggolongannya dan senyawa obat
yang dianalisis ?
1.2.3 Bagaimana metode validasi yang digunakan untuk analisis menggunakan
kromatografi?
1.3 Tujuan Penulisan
Tujuan penulisan berdasarkan rumusan masalah di atas adalah sebagai berikut :
1.3.1 Mengetahui prinsip kerja kromatografi.
1.3.2 Mengetahui penggolongan kromatografi dan senyawa obat yang dianalisis.
1.3.3 Mengetahui metoda validasi yang digunakan untuk analisis menggunakan
kromatografi
 2

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Kromatografi

Kromatografi merupakan metode pemisahan campuran atau larutan senyawa kimia

dengan absorpsi memilih pada zat penyerap, zat cair dibiarkan mengalir melalui kolom zat
penyerap, misalnya kapur, alumina dan semacamnya sehingga penyusunnya terpisah
menurut tingkat kepolaran senyawa, pada sebagian senyawa perbedaan tersebut dapat
dicirikan oleh adanya perbedaan warna (Sastrohamidjojo, 1991). Kromatografi merupakan
pemisahan suatu senyawa yang didasarkan atas perbedaan laju perpindahan dari komponen-
komponen dalam campuran. Pemisahan dengan metode kromatografi dilakukan dengan cara
memanfaatkan sifat-sifat fisik dari sampel, seperti kelarutan, adsorbsi, keatsirian dan
kepolaran. Kelarutan merupakan kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan.
Adsorpsi penjerapan adalah kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk
halus (Johnson dan Stevenson, 1991).

Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak yang dipartisi, kromatografi dapat
digolongkan menjadi beberapa golongan yang ditabelkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Penggolongan kromatografi berdasarkan fasa diam dan fasa gerak.

Berdasarkan sifat instrumen yang digunakan, metode analisis Kromatografi terdiri dari
2 macam yaitu konvensional dan modern. Kromatografi modern adalah teknik pemisahan
komponen zat atau zat aktif dari suatu senyawa yang memiliki berat molekul tinggi dengan
menggunakan instrumen canggih. Alat yang digunakan diantaranya adalah HPLC (High
Performance Liquid Cromatography) dan GC-MS (Gas Cromatography – Mass Spektro).
Kromatografi konvensional merupakan teknik pemisahan yang dilakukan dengan cara
menggunakan instrumen yang sederhana, diantaranya kromatografi kertas, kromatografi
kolom, dan kromatografi lapis tipis.

2.2 Jenis-jenis Kromatografi

Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :
1. Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan
1. Kromatografi Adsorpsi
 3

Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan sekali-kali

dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan keseluruhan. Adsorpsi
pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen,
penarikan dipoldipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan
jenis absorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel
terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:
1) Kromatografi Kertas
Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan
susunan serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem
dua fase.Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase yang kemudianmenjadi fase
diam (umumnya fase yang lebih polar dalam hal kertas yang
dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui
kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas
ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh
gaya gravitasi. Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air
dan fasa penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran
dari salah satu pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda ditandai
dengan penanda.Bila noda tidak berwarna maka harus dideteksi secara fisika dan
kimia.

Kromatografi kertas yaitu kertas mengadsorpsi air dari lingkungan sekitar. Air
tersedia dilingkungan dalam bentuk kelembaban dan bertindak sebagai salah satu
komponen dalam larutan pengelusi (fase gerak). Air juga bertindak sebagai fase
diam. Kromatografi kertas menggunakan sistem “cair-cair”. Kromatografi kertas
banyak digunakan untuk keperluan analitis, dan termasuk dalam kelompok
kromatografi planar, dimana pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam
bentuk bidang (umumnya bidang datar) yaitu bentuk kertas (Sastrohamidjojo, 1991).

Prinsip kromatografi kertas yaitu metode pemisahan dari substansi menjadi

komponen-komponennya yang bergantung pada distribusi suatu senyawa pada dua
fase yaitu fase diam dan fase gerak, pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-
komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan
pada perbedaan bercak warna. Berbagai jenis pemisahan dengan kromatografi kertas
dilakukan yang dikenal sebagai "analisa kapiler". Metoda ini sangat sesuai dengan
kromatografi serapan dan kromatografi kertas sebagai perkembangan dari sistem
partisi (Suryadarma, 2004). Salah satu zat padat yang dapat digunakan untuk
menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

a. Secara fisika dengan menggunakan uap iodium, lampu UV b. Secara kimia

dengan menggunakan pereaksi cerium sulfat,dragendrof, liberman burchard.
Kecepatan elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:
1) Ketebalan kertas .
 4

2) Kekentalan eluen
3) Pelarut, jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat menguap.

Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan gaya kapiler dari bawah
keatas (ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga dengan gaya gravitasi bila
elusinya dari atas ke bawah (descending). Eluen yang digunakan pada kromatografi
kertas umumnya adalah campuran berbagai pelarut terutama air. Kertas kromatografi
yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar bermacam-macam
seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm. Kromatografi kertas serat
fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih kecil dari pada KLT (kromatografi
lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada
KLTtidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan terdekomposisi.
Senyawa obat yang dapat dianalisis contohnya adalah : Amonia, Sulfadiazin,
sulfamerazin, dan sulfanilamide (Ganjar, 2007)

2) Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang dilapiskan
pada lempeng kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan
lempeng kaca. Pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi
atau kombinasi dari kedua efek, tergantung jenis penyangga, cara pembuatan, dan
jenis pelarut yang digunakan. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan
bercak dengan harga Rf yang identik dan ukuran yang hamper sama. Dengan
menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama. Bercak dapat
dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan
diukur secara spektrofotometri. Contoh senyawa obat yang dapat dianalisis yaitu :
Kurkumin (Wulansari, 2011)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan kromatografi planar, yang fase

diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi
senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya (Sastrohamidjojo, 1991).
Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat
sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat
berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan
isolasi senyawa murni skala kecil.

Kromatografi Lapis Tipis merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi
berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta kelarutan dari
 5

komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen

(Suryadarma, 2004). Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia
tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda, sehingga
hal inilah yang menyebabkan pemisahan.

Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis adalah sebagai berikut :

a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
c. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
d. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang
dengan metode kertas tidak bias
e. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
f. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
g. Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)
h. Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).
i. Preparasi sample yang mudah
j. Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak
mungkin
k. Kebutuhan ruangan minimum

Analisis kromatografi lapis tipis banyak digunakan karena :

a. Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek

b. Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang
konstituen utama dalam sampel
c. Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel
d. Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk
analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.
Metode dalam KLT dapat dihitung nilai Retention factor (Rf) dengan persamaan :

Nilai Rf biasanya lebih kecil dari 1, sedangkan jika dikalikan dengan 100
akan bernilai 1-100, sehingga parameter ini dapat digunakan untuk perhitungan
kualitatif dalam pengujian sampel pada kromatografi lapis tipis ( Sumarno, 2001).
Pada Rf kurang 0,2 belum terjadi kesetimbangan antara kompoen senyawa dengan
fase diam dan fase gerak sehingga bentuk noda biasanya kurang simetris. Pada
bilangan Rf diatas 0,8 noda analit akan diganggu oleh absorbansi pengotor
 6

lempeng fase diam yang teramati pada visualisasi dengan lampu UV (Wulandari,
2011). Tetapi pada gugus-gugus yang besar dari senyawa-senyawa yang
susunannya mirip, sering kali harga Rf berdekatan satu sama lainnya
(Sastrohamidjojo, 2002).
3) Kromatografi Partisi
Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan pada
padatan lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan pada
padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya
merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi karena absorpsi juga
mungkin terjadi (Rohman,2007). Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara
dua pelarut yang tak bercampur, salah satunya diam (fase diam) dan yang lainnya
bergerak (fase gerak). Pada tahap awal KC, fase diam dibuat dengan cara yang
sama seperti membuat penyangga kromatografi gas (Johnson, 1991).
4) Kromatografi Eksklusi
Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak
ada interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik karena
dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase
diam). Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat
kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatografi jenis
ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul
(Rohman,2007).
5) Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir
tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam
nukleat, dan protein- 5 protein dalam cairan fisiologis;menentukan kadarsenyawa-
senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis Contoh senyawa obat
yang dapat dianalisis yaitu adalah : Obat golongan analgesic. (Gritter, 1991)
2. Berdasarkan fase yang digunakan Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan
dapat dibedakan menjadi :
1) Kromatografi Padat cair
Bila fase geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf
yang dapat menyerap.
2) Kromatografi gas-padat
Bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat
menyerap/mengadsorp.
3) Kromatografi Cair-cair (k.partisi)
 7

Bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya dilapisi pada
permukaan padatan pendukung yang inert.
4) Kromatografi Gas cair.
Bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang
dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.
3. Berdasarkan alat yang digunakan
Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi :
1) Kromatografi Kolom
Apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak
melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona
pita. Pada kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari kolom akan
dicatat oleh rekorder dan disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang
menunjukkan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Untuk suatu senyawa yang
mengandung komponen tunggal akan ditandai dengan waktu elusi yang tampak
pada konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau luasan puncak sebanding dengan
konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi preparatif, akan diperoleh
sejumlah fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak. Contoh Senyawa
obat adalah Terpenoid ekstraks N-Heksana Rimpang Lengkuas Merah. (Laksono,
2014)

Kromatografi kolom terbagi dalam kromatografi kolom terbuka

(konvensional) dan kromatografi kolom tertutup. Ditinjau dari mekanismenya
kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorpsi. Kromatografi
adsorpsi banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-senyawa organik,
senyawa-senyawa nonpolar dan konsistuen-konstituen yang sulit untuk menguap
(Sastrohamidjojo, 1991).

Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-

komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase
diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat.
Kromatografi cair-padat juga disebut Kromatografi Adsorpsi, metode ini banyak
digunakan untuk analisis biokimia dan organic (Suryadarma, 2014). Teknik
pelaksanaannya dilakukan dengan kolom.Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat
dipilih silika gel atau alumina.

Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi kolom adalah:

a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.

b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relative singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang
mahal dan rumit.
 8

2) Kromatografi Planar (kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas),

Apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak
dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa bentuk noda (spot)
yang dapat dikenali dengan bantuan metode fisika, kimia, maupun biologis. Posisi
noda menunjukkan identitas suatu komponen / senyawa, sedangkan besar atau
intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar beberapa
komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan dengan dua
langkah yang pertama, Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.
3) Kromatografi cair kinerja tinggi atau biasa juga disebut dengan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography)
Dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini,
KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam
amino, asam-asam nukleat, dan proteinprotein dalam cairan
fisiologis;menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping
proses sintesis.
Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan
kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi
yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai
dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan
berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik
tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem
instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan
tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi
yang lebih baik. Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan
kuantitatif yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope
Indonesia adalah kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas,
Kromatografi Lapis Tipis dan KCKT.
4. Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu
dengan memisahkan crude extract menjadi fraksifraksinya yang lebih sederhana.
Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa
geraknya dibantu dengan pompa vakum.Fasa diam yang digunakan dapat berupa
silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008). Fasa diam yang digunakan
dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam
dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:
1) Cara Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa
diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke
 9

dalam kolom dan dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk
lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al.,
2006).
2) Cara Kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan
fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut
selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).
Reparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode
seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering
(Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan
sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV.
Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam.
Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama.
Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan
sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk.
Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam
dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al.,
2006).
Teknik KCV dilakukan dengan suatu sistem yang bekerja pada kondisi vakum
secara terus-menerus sehingga diperoleh kerapatan kemasan yang maksimum atau
menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju alir fasa gerak. Urutan eluen
yang digunakan dalam kromatografi cair diawali dari eluen yang mempunyai tingkat
kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-lahan. Urutan
eluen yang digunakan dalam kromatografi diawali dari eluen yang mempunyai
tingkat kepolaran rendah kemudian kepolarannya ditingkatkan secara perlahan-lahan
(Hosstetmann et al., 1995). Berikut ini merupakan urutan eluen pada kromatografi
berdasarkan kenaikan tingkat kepolarannya :

2.3 Validasi dengan Menggunakan Metode Kromatografi

1. Kecermatan (Accuracy)
 10

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis

dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan
kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung
kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu
untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi
galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi,
menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya
yang cermat, taat asas sesuai prosedur.
Cara penentuan: Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi
(spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).
Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam campuran
bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan
hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).
Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang
diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua
hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan). Dalam
kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil
yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. % Perolehan kembali dapat ditentukan
dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian
ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar
analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi.
2. Keseksamaan (precision)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen.
Cara penentuan: Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku
relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan
(repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan
metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan
dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan
terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama,
jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Ketertiruan adalah
keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis
dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan,
pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analis dilakukan terhadap sampel-
sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga
dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan
analis yang berbeda. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan
baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat
 11

fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi
laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan
menurunnya kadar analit yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat
seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar
deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah
5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per
bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa
RSD harus lebih dari 2%.
3. Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur
zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai
derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang
mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak
mengandung bahan lain yang ditambahkan.
Cara penentuan: Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis
sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya
atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan
tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika
cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka
selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung
cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan
metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, analisis kelarutan fase,
dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut
merupakan ukuran selektivitas. Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi,
selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya resolusinya (Rs).
4. Linearitas dan Rentang
Linearitas dan Rentang Definisi: Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang
memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik
yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode
adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat
ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.
Cara penentuan: Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis
regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil
uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam
pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat
terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Dalam beberapa kasus, untuk
memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit,
data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis
 12

regresinya. Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya
antara 50 – 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan
rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Jumlah sampel yang dianalisis
sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko.
5. Batas Deteksi dan Batas Kuantisasi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi
merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis
renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat
memenuhi kriteria cermat dan seksama.
Cara penentuan: Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada
metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak
menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam
sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat
dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku
respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi
Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko
Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi =
slope (b pada persamaan garis y = a+bx)
6. Ketangguhan metode (ruggedness)
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis
sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis,
instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll. Ketangguhan biasanya
dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja
pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi
normal antara lab dan antar analis.
Cara penentuan: Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu
lot sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda
menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi
menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Derajat ketertiruan hasil uji
kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. Ketertiruan dapat
dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal untuk
mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Perhitungannya dilakukan secara statistik
menggunakan ANOVA pada kajian kolaboratif yang disusun oleh Youden dan Stainer.
7. Kekuatan (Robustness)
 13

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang
kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi.
Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur
HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak
(1%), pH fase gerak (± 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom (± 2 - 3° C).
Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi
sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau
diubah. Faktor orisinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai
faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi
yang telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan (Harmita, 2004).
 14

BAB 3
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
1. Kromatografi merupakan pemisahan suatu senyawa yang didasarkan atas perbedaan laju
perpindahan dari komponen-komponen dalam campuran. Pemisahan dengan metode
kromatografi dilakukan dengan cara memanfaatkan sifat-sifat fisik dari sampel, seperti
kelarutan, adsorbsi, keatsirian dan kepolaran.
2. Berdasarkan sifat instrumen yang digunakan, metode analisis Kromatografi terdiri dari
2 macam yaitu konvensional dan modern. Kromatografi modern adalah teknik
pemisahan komponen zat atau zat aktif dari suatu senyawa yang memiliki berat molekul
tinggi dengan menggunakan instrumen canggih. Alat yang digunakan diantaranya
adalah HPLC (High Performance Liquid Cromatography) dan GC-MS (Gas
Cromatography – Mass Spektro). Kromatografi konvensional merupakan teknik
pemisahan yang dilakukan dengan cara menggunakan instrumen yang sederhana,
diantaranya kromatografi kertas, kromatografi kolom, dan kromatografi lapis tipis
3. Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Parameter yang digunakan dalam proses
validasi dengan spektrometri meliputi : Kecermatan (accuracy), Keseksamaan
(Precision), Selektivitas ( Spesifitas), Linearitas dan rentang, Batas Deteksi dan Batas
Kuantitasi, Ketangguhan metode ( ruggedness), Kekuatan (Robustness)
 15

DAFTAR PUSTAKA

Cannell, R.J. 1998. How to approach the isolation of a natural product. Natural products
isolation, 1-51.

Gritter , R.J, Bobbic, J.N., dan Schwarting, A.E.. 1991. Pengantar Kromatografi , diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata, Edisi II, Bandung; ITB Press Bandung.

Ghisalberti, E.L. 2008. Detection and Isolation of Bioactive Natural Products in Bioactive
Natural Products: Detection, Isolation, and Structural Determination. USA; Taylor &
Francis Group Inc.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu
Kefarmasian, Vol. I, No. 3, Desember.

Johnson, L.E. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Al

Laksono, F., B., Fachriyah, E., dan Kusrini, D., 2014. Isolasi dan Uji Bakteri Senyawa Terpenoid
Ekstrak N-Heksana Rimpang Lengkuas Merah (Alpinia purpurata). Jurnal Kimia Sains
dan Aplikasi. Vol 17(2). 37-42

Lestari, R., 2016. Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk
Penetapan Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit
Merek “X”. Skripsi. Yogyakarta; Universitas Sanata Dharma.

Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Rohman, A., 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat. Yogyakarta; Graha Ilmu.

Rohman, A., 2014. Validasi Penjaminan Mutu Metode Analisis Kimia. Yogyakarta: UGM Press.

Sarker S.D., Zahid L., dan Alexander I.G., 2006. Natural Products Isolation. New Jersey;
Humana Press.

Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi.Yogyakarta: Penerbit Libery UGM

Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Yogyakarta: Liberty.

Suryadarma, M. 2004. Pengembangan Metode Analisis. Surabaya: Airlangga Press.

Wulansari, Y., D., 2011. Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)- Densitometri Pada
Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar (OHT) Kiranti.
Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma.