See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/339133017

WESTERN BLOTTING

Article · January 2018

CITATIONS
READS
0
841

1 author:

Andre Setiawan
Brawijaya University
18 PUBLICATIONS 6 CITATIONS

All content following this page was uploaded by Andre Setiawan on 09 February 2020.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 LAPORAN PRAKTIKUM
INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE

WESTERN BLOTTING

OLEH:
ANDRI SETIAWAN
NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Western blot adalah teknik untuk mengidentifikasi antibodi spesifik pada
protein yang telah dipisahkan antara satu dengan yang lain menurut ukurannya
melalui elektroforesis gel. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan
dasar nitroselulose atau PVDF (Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan diatas
membran dan aliran listrik akan menginduksi protein pada gel untuk berpindah
pada membran. Membran tersebut akan menjadi replika dari pola protein pada gel
yang kemudian diwarnai secara sekuensial dengan antibodi.
Western blot digunakan secara luas untuk mengidentifikasi dan
mengkuantifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik
ini memungkinkan deteksi tidak langsung sampel protein yang diimobilisasi pada
membran nitroselulose. Sampel protein terlebih dahulu di running dengan SDS –
PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke membran. Setelah langkah blocking,
membran di probe dengan antibodi primer baik monoclonal maupun poliklonal
yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial,
membran kemudian diinkubasi dengan antibody sekunder yang dikonjugasi
dengan enzim yang sifatnya reaktif terhadap antibodi. Pada akhirnya, membran
dicuci kembali dengan substrat dari enzim yang tepat yang akan memproduksi
sinyal yang dapat direkam (Pierce, 2011).
Saat ini, telah banyak reagen antibodi baik poliklonal maupun monoklonal
untuk 10.000 jenis protein. Sehingga western blot sangat bermanfaat untuk
digunakan bersama antibody tersebut. Western blot dapat memberikan informasi
tentang berat molekul protein dan jumlah ekspresi protein. Western blot dapat
menganalisis sampel protein dari sel maupun jaringan.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dilakukan praktikum ini adalah untuk :
1. Mengetahui prinsip kerja dari Western blot.
2. Melakukan prosedur Western blot.
3. Mengidentifikasi berat molekul dari sampel
 BAB II
METODE PRAKTIKUM

2.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum Western Blotting ini dilaksanakan pada Rabu, 28 Maret 2018
di Laboratorium Sentral Biomedik, Universitas Brawijaya, Malang.

2.2 Bahan dan Alat

2.2.1 Bahan
Bahan kimia yang digunakan antara lain gel dari hasil SDS-PAGE,
membran nitroselulosa, H2O, TBS Skim Milk 5%, TBS Tween 0,05%,
antibodi primer, TBS-Tween 0.05%, BSA 0,02%, antibodi sekunder
(Peroksidase/Biotin Conjugate), Ponceau 5%, aquades, TMB dan kertas
saring Whatman.
2.2.2 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sentrifus, dry es,
inkubator, refrigerator, mikropipet, yellow tip, semy dry transblotter,
chamber electroforesis, plate pembentuk gel dan shaker.

2.3 Cara kerja

Gel hasil elektroforesis direndam bersama kertas saring Whatman
dalam TBST (TBS mengandung Tween-20 0.05%) selama 5 menit. Membran
nitroselulosa direndam dalam transfer buffer selama 5 menit. Kertas saring,
membran nitroselulosa, gel dan kertas saring disusun berurutan pada semidry
trasnblot, kemudian transfer dilakukan pada pada arus 0,3 A tegangan 20 V
selama 2 jam.
Prosedur selanjutnya adalah pewarnaan Ponceau 2%, tapi pada
praktikum ini tidak dilakukan. Setelah running 2 jam, sampel diambil dan
dipisahkan dengan kertas saring. Marker akan terlihat jelas apabila transfer
yang dilakukan sempurna. Kemudian marker dipotong, lalu dilakukan
bloking dengan TBS Skim Milk 5 % semalam pada suhu 40 C.
Setelah overnight, dilakukan washing TBS tween 0.05% selama 3x5
menit, di Shaker pelan. Kemudian inkubasi dalam antibodi primer dengan
 rasio pengenceran 1; 200 dalam pelarut TBS dan BSA 0,02% Selama 2 jam.
Selanjutnya dicuci kembali dengan TBS tween 0.05% selama 3x5 menit, di
shaker pelan.
Prosedur selanjutnya adalah inkubasi dalam antibodi sekunder
(Peroksidase/Biotin Conjugate) perbandingan rasio pengenceran 1;100
dalam pelarut TBS, selama 2 jam, suhu ruang dan di shaker pelan.
Kemudian cuci kembali dengan TBS tween 0.05% selama 3x5 menit, di
shaker pelan.
Inkubasi dalam SAHRP selama 1 jam di suhu ruang dan di shaker
pelan, cuci kembali dengan TBS tween 0.05% selama 3x5 menit, di shaker
pelan. Kemudian ditambahkan substrat TMB ± 20 menit sampai muncul
band protein, selanjutnya untuk menghentikan katalisasi ditambahkan
dengan aquades dan dikeringkan. Selanjutnya hasil band protein yang
didapatkan di scanning.

2.4 Resep
1. Transfer Buffer: Tris base 0,303 gr
Glicine 1,44 gr
Methanol 20 ml
Akuades steril 100 ml
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil
Setelah dilakukan stop reaksi dengan akuades steril, dikeringkan
kemudian discan didapatkan band-band protein spesfik yang terbentuk pada
membrane Nitroselulosa seperti tampak di bawah ini.

1 2 marker
3 4 56 7 89

Gambar Hasil Pengamatan Band Spesifik pada membran nitroselulose

Gambar Market GangNam-STAIN Prestained Protein Ladder, Ready to use, 12bands

between 10 kDa to 245 kDa, 80 applications, 0.25ml (GangNam-Stain. 2018).
3.2 Pembahasan
Pada praktikum western blot diperoleh band dengan warna biru kecoklatan
di membrane Nitroselulosa pada sampel 1 dan 3. Selanjutnya band sampel
tersebut dibandingkan dengan marker dan diperoleh berat molekul antara 63-75
kDa (berat molekul sampel berada sejajar diantara band berwarna merah dan band
biru yang terdapat pada marker). Band yang terlihat pada membran nitroselulose
merupakan band protein yang berikatan dengan antibody yang diberikan. Pada
praktikum ini sampel gel yang telah ditransfer ke membran, diberikan antibodi
protein 60 kDa pada 9 sampel yaitu OMP Escherichia coli kemudian dilihat
apakah terdapat reaksi silang antara sampel protein dengan antibodi yang
diberikan pada 9 sampel tersebut. Pada praktikum, tidak dilakukan cara
menentukan berat molekul, secara spesifik sehingga tidak dapat diketahui berat
molekulnya.
Western blotting gel hasil elektroforesis direndam dalam Tranfer buffer
beserta kertas saring Whatman. Perendaman ini dilakukan agar gel maupun kertas
saring dapat menyerap buffer yang nantinya digunakan sebagai penghantar arus
listrik saat pemindahan dari gel ke membran nitroselulosa dengan menggunakan
teknik semidry. Teknik semidry didasarkan pada pemakaian larutan buffer dalam
jumlah terbatas yaitu larutan yang diserap oleh kertas saring. Tranfer protein
dilakukan dengan menggunakan membran nitoselulosa dimana membran ini
mempunyai kapasitas pengikatan yang lebih tinggi (Walker, 2002).
Pencucian dengan TBS yang mengandung Tween-20 digunakan untuk
meminimalkan penyerapan ikatan protein-non spesifik serta protein dan matrik
dengan merusak interaksi hidrofobik/non kovalen sehingga tidak mengganggu
ikatan antigen-antibodi.
Western blotting seharusnya menghasilkan deteksi satu atau beberapa pita.
Meskipun antibodi secara langsung melawan protein tunggal seharusnya
menghasilkan pita tunggal, degradasi dari sampel (misalnya adanya aktivitas
proteolitik) diduga menyebabkan visualisasi dari beberapa pita dengan ukuran
yang berbeda. Multimer akan terbentuk secara spontan yang menyebabkan pita
dengan berat molekul tinggi terdapat pada hasil bloting (Ausubel et al, 2003).
Multiple band juga dapat terbentuk akibat konsentrasi antibodi primer yang terlalu
tinggi oleh karena itu konsentrasi antibodi harus diturunkan. Konsentrasi
antibodi sekunder
yang terlalu tinggi juga akan mengakibatkan pengikatan yang tidak spesifik
terhadap antigen.
Western blotting biasanya digunakan untuk menentukan kadar relatif dari
suatu protein dalam suatu campuran berbagai jenis protein atau molekul lain.
Metode western blotting menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan
spesifisitas imunoassay, sehingga setiap jenis protein dapat dideteksi dan dianalisa
dengan menggunakan metode probe antibodi yang sesuai. Protein-protein dalam
campuran itu sebelumnya dipisahkan satu dengan yang lain dengan cara
elektroforesis gel, khususnya cara SDS-PAGE. Posisi akhir setiap jenis protein
dalam gel poliakrilamid setelah elektroforesis dihentikan sesuai dengan berat
molekul masing-masing. Protein-protein yang telah dipisahkan satu dengan yang
lain itu kemudian dipindahkan dari gel ke membran pendukung melalui proses
kapiler (blotting) demikian rupa sehingga membran tersebut mendapatkan
replikan dari susunan makromolekul seperti yang terdapat pada gel. Posisi antigen
yang dicari dapat diidentifikasi pada membran dengan mereaksikannya dengan
antibodi spesifik yang bertanda atau dilabel dengan radioisotop atau enzim.
Berbagai jenis membran sintetik dapat mengikat protein secara kuat sehingga
dapat dimanfaatkan sebagai media transport/membran pendukung untuk
imunoassay pada media padat. Protein yang diikat pada mebran dapat
mempertahankan antigenitasnya dan dengan mudah direaksikan dengan antibody
(Kresno 2003).
 BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum Western Blotting ini adalah sebagai berikut:
1. Western blot merupakan metode untuk mengidentifikasi antibodi spesifik
pada suatu protein dengan berat molekul tertentu yang telah diseparasi.
Pada awalnya berat molekul protein diseparasi atau dipisahkan dengan
menggunakan SDS-PAGE elektroforesis dan ditransfer ke membrane
nitrocellulose (NC) selanjutnya di lakukan labeling Antibodi.
2. Pada dasarnya prosedur dariWestern blot adalah Gel SDS-PAGE ditransfer
ke membrane Nitroselulose, selanjutnya imunostainining (Bloking Non
spesifik, inkubasi antibody primer, inkubasi antibody sekunder, inkubasi
enzim SA-HRP, dan inkubasi substrat).
3. Identifikasi berat molekul sampel dengan cara membandingkan band yang
terpendar pada menbran nitroselulose sejajar dengan marker.

4.2 Saran
Untuk praktikum selanjutnya perlu dilakukan perhitungan berat molekul secara
spesifik.
 DAFTAR PUSTAKA

Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith

and K. Struhl. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. Jhon Wiley
and Sons. New York.
GangNam-Stain. 2018. Prestained Protein Ledder Manual Book. iNtRON
Biotechnology, Inc.
Kresno BS. Unsur-unsur yang berperan dalam reaksi imunologi. Imunologi:
Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Edisi ke-IV cetakan ke-2. Jakarta;
FKUI:2000.p.44-81
Pierce. 2011. Western Bloting Handbook and Troubleshooting. http//www.
piercenet.com/Proteomics/. Tanggal akses 7 April 2018.
Walker, J. M. 2002. The Protein Protocols Handbook. Humana Press. New Jersey.
Halaman 265-333.

View publication stats