Tugas Pengerjaan Interpretasi Biologi Molekuler

dr. Bobby Rianto Adi Putra

04052722125008

Obstetri dan Ginekologi

Pembimbing
Dr.dr Mgs. Irsan Saleh, M.Biomed

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER

SPESIALIS FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SRIWIJAYA PERIODE
JANUARI 2021
 Pedoman Teknik Western Blotting (WB)
untuk Pemisahan dan Isolasi Protein

Western blotting adalah teknik penting yang digunakan dalam biologi sel dan
molekuler. Dengan menggunakan western blot, para peneliti dapat mengidentifikasi
protein spesifik dari campuran kompleks protein yang diekstraksi dari sel. Teknik ini
menggunakan tiga tahapan:
(1) Pemisahan berdasarkan ukuran,
(2) Transfer ke penyangga padat, dan
(3) Menandai protein target menggunakan antibodi primer dan sekunder yang sesuai
untuk divisualisasikan.

PENDAHULUAN
Western blots sering digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi protein. Dalam
teknik ini campuran protein dipisahkan oleh berat molekul berdasarkan jenisnya melalui
elektroforesis gel. Hasilnya kemudian ditransfer pada membran dan menghasilkan pita
untuk setiap protein. Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi berlabel khusus
untuk protein yang diinginkan.

PERSIAPAN SAMPEL
Sel Lysate adalah bentuk sampel yang paling umum digunakan untuk teknik western
blots. Pengambilan protein dilakukan untuk mengumpulkan semua protein di dalam sel
sitosol. Ini harus dilakukan dalam suhu dingin dengan protease inhibitor untuk
mencegah denaturasi protein. Sejak sampel jaringan menampilkan level struktur yang
lebih tinggi, dibutuhkan penemuan mekanis, seperti homogenisasi atau sonikasi untuk
mengekstrak protein.
Setelah mengekstraksi protein, sangat penting untuk mengetahui konsentrasi ekstraknya.
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Dengan
menggunakan konsentrasi ini dapat digunakan untuk mengukur massa protein yang
dimuat sesuai konsentrasi, massa dan volume.

ELEKTROFORESIS GEL
Western blots menggunakan dua jenis gel agarosa: menumpuk dan memisahkan gel.
Semakin banyak, tumpukan gel bersifat asam (pH 6,8) dan memiliki konsentrasi
akrilamida yang lebih rendah untuk membuat gel berpori, yang memisahkan protein
tetapi memungkinkan untuk dibentuk pita tipis dan tajam. Gel bawah, disebut gel
pemisah atau regulasi, bersifat basa (pH 8,8), dan memiliki kandungan poliakrilamida
yang lebih tinggi, membuat pori-pori gel lebih sempit. Jadi protein dipisahkan oleh
ukurannya pada gel ini, karena protein yang lebih kecil bergerak lebih mudah dan lebih
cepat daripada protein yang lebih besar.
Protein saat dimuat pada gel memiliki muatan negatif, karena didenaturasi dengan
pemanasan, dan bergerak menuju elektroda positif saat diberi tegangan. Gel biasanya
dibuat dengan menuangkannya di antara dua cangkir atau piring plastik. Sampel dan
markernya dimuat ke dalam perigi dimuat dengan buffer sampel. Gel tersebut kemudian
dihubungkan ke power supply dan dibiarkan berjalan. Tegangan sangat penting, karena
tegangan yang tinggi dapat menyebabkan panas berlebih dan merusak pita.

BLOTTING
Setelah memisahkan campuran protein, kemudian pindahkan ke membran. Pemindahan
dilakukan dengan menggunakan medan listrik yang berorientasi tegak lurus permukaan
gel sehingga menyebabkan protein keluar dari gel dan menuju membran. Membran
ditempatkan di antara permukaan gel dan elektroda positif. Sandwich berisi bantalan
serat (spons) di setiap ujungnya, dan kertas saring untuk melindungi gel dan membran
blotting [Gambar 12].
Di sini dua hal yang sangat penting:
(1) kontak dekat gel dan membran untuk memastikan gambar yang jelas dan
(2) penempatan membran antara gel dan elektroda positif.
Membran harus ditempatkan sedemikian rupa sehingga protein bermuatan negatif dapat
berpindah dari gel ke membran. Jenis transfer ini disebut transfer elektroforetik, dan
dapat dilakukan dalam kondisi semi kering atau basah. Kondisi basah biasanya lebih
dapat diandalkan karena cenderung mengeringkan gel, dan lebih disukai untuk protein
yang lebih besar.
Membran penyangga yang kuat, merupakan bagian penting dari proses ini. Ada dua
jenis membran: nitroselulosa dan PVDF. Nitroselulosa digunakan untuk afinitas tinggi
terhadap protein dan kemampuan retensi. Namun, rapuh, dan tidak memungkinkan
membran digunakan untuk reprobing. Dalam hal ini, membran memberikan dukungan
mekanis yang lebih baik dan memungkinkan noda untuk digunakan kembali dan
disimpan. Namun, latar belakang pada membran PVDF lebih tinggi dan oleh karena itu,
pencucian yang cermat sangat penting.

WASHING, BLOCKING, DAN INKUBASI ANTIBODI

Blocking adalah langkah yang sangat penting dari western blotting, karena mencegah
antibodi mengikat membran nonspesifik. Pemblokiran sering dilakukan dengan 5%
BSA atau susu tanpa lemak kering yang diencerkan dalam TBST untuk mengurangi
background.
Susu bubuk tanpa lemak sering disukai karena murah dan banyak tersedia. Namun,
protein susu tidak kompatibel dengan semua label deteksi, jadi harus berhati-hati dalam
memilih solusi blocking yang tepat. Sebagai contoh, larutan penghambat BSA lebih
disukai diberi label dengan biotin dan antibodi AP, dan antibodi antifosfoprotein, karena
susu mengandung kasein, yang juga merupakan fosfoprotein dan biotin, sehingga
mengganggu hasil tes. Seringkali merupakan strategi yang baik untuk menginkubasi
antibodi primer dengan BSA karena biasanya dibutuhkan dalam jumlah yang lebih
tinggi daripada antibodi sekunder. Menempatkannya dalam larutan BSA
memungkinkan antibodi digunakan kembali, jika noda tidak memberikan hasil yang
baik.
Konsentrasi antibodi tergantung pada instruksi pabrikan. Antibodi dapat diencerkan
dalam buffer pencuci, seperti PBS atau TBST. Washing sangat penting karena
meminimalkan latar belakang dan menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Namun,
membran sebaiknya tidak dicuci dalam waktu yang lama, karena ini juga dapat
mengurangi sinyal.
Membran kemudian dideteksi menggunakan antibodi berlabel, biasanya dengan enzim
seperti horseradish peroxidase (HRP), yang dideteksi dengan sinyal yang dihasilkannya
sesuai dengan posisinya dari protein target. Sinyal ini ditangkap pada film yang di
ruangan gelap.

COUNT ATAU PENGHITUNGAN

Data yang dihasilkan dengan western blots biasanya dianggap semi-kuantitatif.
Perbandingan kandungan protein yang dihasilkan bersifat relatif, tetapi bukan ukuran
kuantitas absolut. Penyebabnya adalah variasi dalam kecepatan pemuatan dan transfer
antar sampel pada baris bercak terpisah dan sinyal yang dihasilkan oleh deteksi tidak
linier di seluruh rentang konsentrasi sampel. Sehingga sinyal tersebut tidak boleh
digunakan untuk memodelkan konsentrasi.

PROTOKOL UNTUK MENGEKSTRAKSI PROTEIN DARI SEL ADHEREN

1. Cuci sel dalam labu atau wadah kultur jaringan dengan menambahkan buffered
saline fosfat dingin (PBS) dan kocok perlahan. Buang PBS. (Simpan wadah
kultur jaringan di atas es).
2. Tambahkan PBS dan gunakan pengikis sel untuk membuang sel. Pipet campuran
tersebut ke dalam tabung microcentrifuge.
3. Centrifuge pada 1500 RPM selama 5 menit dan buang supernatannya.
4. Tambahkan 180 µL buffer lisis sel dingin dengan 20 µL koktail protease
inhibitor segar. (Jika konsentrasi protein tidak cukup tinggi di akhir, disarankan
untuk mengulangi prosedur dengan proporsi yang lebih tinggi dari campuran
protease inhibitor)
5. Inkubasi selama 30 menit di es, lalu klarifikasi lisat dengan memutarnya selama
10 menit pada 12.000 RPM, pada 4°C.
6. Pindahkan supernatan (atau campuran protein) ke tabung baru dan simpan di
atas es atau bekukan pada -20°C atau -80°C
7. Ukur konsentrasi protein menggunakan spektrofotometer.

PERSIAPAN SAMPEL
1. Tentukan volume ekstrak protein untuk memastikannya 50 μg di setiap lubang.
2. Tambahkan 5 μL buffer sampel ke sampel, dan buat volume di setiap baris
disamakan dengan menggunakan H2O suling ganda (dd H2O). Aduk rata
(disarankan volume total 15 μL per baris).
3. Panaskan sampel dengan pelat kering selama 5 menit pada suhu 100°C.

PERSIAPAN GEL
1. Setelah menyiapkan 10% larutan gel batching, pasang rak untuk memadatkan
gel [Gambar 1]. (10% AP dan TEMED memperkuat larutan; Kedua gel dapat
dibuat pada waktu yang sama, jika reagen tersebut tidak ditambahkan di akhir).
 2. Tambahkan larutan stacking gel dengan hati-hati sampai sejajar dengan stick
hijau yang menahan pelat kaca [Gambar 2]. Tambahkan H 2O sampai ke atas.
Tunggu 15-30 menit agar gel berputar dan mengeras. (Menggunakan pipet isap
dapat mempermudah proses penambahan gel ke piring kaca).
3. Lapisi gel yang menumpuk dengan gel pemisah, setelah air keluar. (Lebih baik
memiringkan peralatan dan menggunakan handuk kertas untuk menghilangkan
air).
4. Masukkan comb, pastikan tidak ada gelembung udara.
5. Tunggu hingga gel mengeras. (Solidifikasi dapat dengan mudah diperiksa
dengan meninggalkan beberapa larutan gel di dalam tabung).

ELEKTROFORESIS
1. Tuang run buffer ke elektroforator [Gambar 3].
2. Tempatkan gel di elektroforator dan hubungkan ke catu daya. (Saat
menyambungkan ke sumber listrik, selalu sambungkan merah ke merah, dan
hitam ke hitam).
3. Pastikan penyangga menutupi gel sepenuhnya, dan angkat comb dengan hati-
hati.
4. Marker load (6 µL) diikuti oleh sampel (15 µL) untuk setiap perigi [Gambar 4].
5. Jalankan gel pada tegangan rendah (60 V) untuk memisahkan gel; gunakan
tegangan yang lebih tinggi (140 V) untuk mengakumulasi gel [Gambar 5a dan
5b].
6. Jalankan gel selama kurang lebih satu jam, atau sampai bagian depan pewarna
terkuras dari dasar gel [Gambar 6].

ELEKTROTRANSFER
1. Potong 6 lembar filter agar sesuai dengan ukuran gel, dan satu membran
polivinilidena fluorida (PDVF) dengan dimensi yang sama.
2. Basahi spons dan kertas saring dalam transfer buffer, dan basahi membran
PDVF dalam metanol.
3. Pisahkan piring kaca dan ambil gelnya.
4. Buat sandwich transfer sebagai berikut
 Spons
 Kertas Saring
  Gel PVDF
 Kertas Saring (Pastikan tidak ada gelembung udara di antara gel dan
membran PVDF, dan peras kelebihan cairannya)
5. Pindahkan sandwich ke perangkat transfer, yang harus diletakkan di atas es
untuk menjaga suhu 4°C. Tambahkan buffer transfer ke peralatan, dan pastikan
sandwich ditutupi dengan buffer. Letakkan elektroda di atas sandwich, pastikan
membran PVDF berada di antara gel dan elektroda positif [Gambar 7]
6. Transfer selama 90 menit [Gambar 8]. (Waktu pengerjaan harus proporsional
dengan ketebalan gel, dapat dikurangi menjadi 45 menit untuk gel 0,75 mm)

ANTIBODI BLOCKING DAN INKUBASI

1. Blok membran dengan susu skim 5% di TBST selama 1 jam
2. Tambahkan antibodi primer dalam 5% bovine serum albumin (BSA) dan
inkubasi semalaman dalam suhu 4 ° C pada shaker [Gambar 9].
3. Cuci membran dengan TBST selama 5 menit. Lakukan ini 3 kali. (Semua
langkah pencucian dan inkubasi antibodi harus dilakukan pada shaker pada suhu
kamar untuk memastikan agitasi merata).
4. Tambahkan antibodi sekunder dalam susu skim 5% di TBST, dan inkubasi
selama 1 jamm.
5. Cuci membran dengan TBST selama 5 menit. Lakukan ini 3 kali
6. Siapkan campuran ECL (mengikuti proporsi larutan A dan B yang disediakan
oleh pabrikan). Inkubasi membran selama 1-2 menit [Gambar 10]. (Gunakan
pipet 1000 μL untuk memastikan ECL menutupi bagian atas dan bawah
membran)
7. Baca hasilnya di ruangan gelap [Gambar 11]. (Jika latar belakang terlalu kuat,
kurangi lamanya eksposur).

RESEP
1. Larutkan bahan berikut dalam 800 ml H2O
 8,8 g NaCl
 0,2 g KCl
 3g Tris base
2. Tambahkan 500ul Tween-20
 3. Sesuaikan pH menjadi 7,4
4. Tambahkan H2O suling hingga mencapai 1 L
5. Sterilkan dengan penyaringan atau autoklaf

Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3 Gambar 4 Gambar 5 a dan b

Gambar 6 Gambar 7 Gambar 8 Gambar 9 Gambar 10

Gambar 11 Gambar 12

REFERENSI
Kaufman, R. E., D. C. Olansky, and P. J. Wiesner. 1974. The FTA-ABS (IgM)
test for neonatal congenital syphilis: a critical review. J. Am. Vener. Dis. Assoc.
1:79-84.
Lewis, L. L., L. H. Taber, and R. E. Baughn. 1990. Evaluation of immunoglobulin
M Western blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Microbiol.
28:296-302.
McKelvey, J. L., and T. B. Turner. 1934. Syphilis and pregnancy: analysis of the
outcome of pregnancy in relation to treatment in 943 cases. JAMA 102:503-510.
Meyer, M. P., D. Roditi, and S. Louw. 1992. IgM rheumatoid factor removal and
performance of the FA-ABS (IgM) test in congenital syphilis. Genitourin. Med. 68:249-
253.