PNC PAGE

Preparative Native Continue Polyacrylamide

Gel Electrophoresis

Start!
 Kelompok 7 1

1. Muh. Ikhzan Jasdar (H031211029)

2. Nur Azisah Irsyam (H031211030) 2
3. Ayu Pradila (H031211031)
4. Viona Dwi Putri Ramadhani M (H031211033)
5. Suhasti (H031211035) 3

6. Aisyah Nursyifa (H031211038)

7. Fahra Aqila Azzurah (H031211044)
4
 1. Pendahuluan 1

Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan partikel (biomolekul)

bermuatan di dalam media yang diberi arus atau medan listrik.
2
Dengan metode tersebut partikel bermuatan akan bergerak menuju
elektroda yang memiliki muatan yang berlawanan
- Anoda (elektroda + ) menarik anion
- Katoda (elektroda ) menarik kation
3

Pada elektroforesis gel, molekul yang ingin dipisahkan didorong oleh

medan elektrik melalui sebuah gel yang berpori kecil. Molekul akan
berjalan melalui pori dalam gel pada kecepatan yang berbanding terbalik
dengan panjangnya. Artinya, molekul yang lebih kecil akan melalui jarak 4
yang lebih jauh melalui gel daripada molekul yang lebih besar.
 2. Jenis-Jenis Elektroforesis Gel 1

Elektroforesis Protein
1. Elektroforesis 1D
2
- SDS PAGE
- Native PAGE
- Isoelectric Focusing (IEF)
3
2. Elektroforesis 2D
- 2-D Electrophoresis

4
 3. Native-PAGE 1

Native polyacrilamide gel electrophoresis (native-PAGE)

merupakan metode untuk memisahkan protein
berdasarkan ukuran, bentuk dan muatan dengan 2

menghindarkannya dari perlakuan yang bisa menimbulkan

denaturasi.
Setelah elektroforesis, protein dapat diambil kembali dari 3
gel Native-Page dengan difusi pasif atau elektro elusi. Agar
integritas protein selama elektroforesis dapat
dipertahankan, sangat penting untuk menjaga peralatan
tetap dingin dan meminimalkan efek denaturasi dan 4
proteolisis.
 1

Native-PAGE dapat memisahkan kompleks protein yang

berkisar antara 100 kDa hingga 10 MDa dan dapat disesuaikan
2
tergantung pada rentang konsentrasi akrilamida dalam gel
gradien.
Native-PAGE menggunakan pewarna coomassie brilliant
blue G-50 untuk mengikat protein dan memberikan muatan 3
negatif sambil mempertahankan protein dalam keadaan
aslinya tanpa terdenaturasi. Adanya G-250 dalam buffer
katoda agar dapat memberikan aliran terus menerus ke dalam
gel dan ditambahkan ke sampel yang mengandung detergen 4
non-ionik sebelum memasukkan sampel ke dalam gel.
 M

Pengikatan G-250 ke protein memberikan keuntungan T

yaitu menghasilkan resolusi tinggi pada native-page
(Schagger, 2001):
1) G-250 mengubah protein menjadi muatan negatif bersih W

yang memungkinkan protein berpindah ke satu arah

menuju anoda
2) Protein membran dan protein dengan area hidrofobik T
yang terpapar permukaan yang signifikan kurang rentan
terhadap agregasi
F
 M
Jurnal Acuan

Science T

F
 Latar Belakang
Berangkat dari permasalahan Astringensi atau disebut juga
penyebab mulut terasa kering, telah menjadi perhatian besar bagi industri
makanan, karena sensasi yang tidak menyenangkan ini dapat membatasi
penerimaan konsumen terhadap banyak makanan. Astringensi
didefinisikan sebagai sensasi kering, kasar dan kerutan yang terasa
dimulut. Astringensi umumnya dikaitakan dengan komsumsi polifenol
seperi tanin, tetapi juga protein makanan, garam kation multivalen (yaitu
garam aluminium), agen dehidrasi (yaitu etanol), dan molekul kecil lainnya
seperti flavonoid (yaitu quercetin), asam fenolik (yaitu asam pcoumaric),
dan saponin. secara umum diakui bahwa astringensi berasal dari interaksi
senyawa makanan dengan air liur dan struktur di rongga mulut. Mekanisme
astringensi yang paling banyak dipelajari difokuskan pada interaksi antara
senyawa astringen, terutama tanin, dan PRP saliva.
 Latar Belakang
Saliva adalah cairan fisiologis yang melapisi rongga mulut sebagai
pelumas, dan memainkan peran penting dalam proses oral dan pencernaan
makanan. Terdiri dari hampir 99% air dan campuran elektrolit, asam lemak
dan protein, kaya prolin (PRPs), statherin, cystatins, mucin dan histatin.
Maka dari itu untuk mengetahui interaksi antara protein nabati dan saliva,
yang sangat penting untuk formulasi makanan nabati dengan kandungan
protein yang lebih tinggi dengan mekanisme astringensi menggunakan
bahan dasar kacang polong (Pisum sativum L.) dalam formulasi makanan
nabati telah menjadi sangat populer karena rendahnya alergenisitas
tanaman dan nilai gizinya yang tinggi kandungan dan kualitas proteinnya
menjadi perhatian khusus. Bahkan, isolat protein kacang polong (PPI) kini
digunakan sebagai salah satu bahan utama dalam industri alternatif daging
dan susu.
 Tujuan Penelitian

Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi

protein yang terlibat dalam interaksi antara protein kacang polong dan
protein saliva yang mengarah pada pembentukan endapan ketika PPI dan
saliva dicampur. Identifikasi protein yang terlibat dalam interaksi tersebut
dapat memberikan wawasan lebih lanjut tentang mekanisme yang
mendasari persepsi astringency. Dengan menggunakan beberapa teknik
canggih, termasuk Shotgun Liquid Chromatography-Mass Spec trometry
(LC-MS) dan Native-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE).
 Metode Penelitian
1. Size Exclusion Chromatography (SEC)
Metode ini dilakukan dengan kolom Superdex 200
Increase 10/300 GL dengan laju aliran 0,5 mL/menit (UV 280
nm), pada suhu kamar. Kolom diseimbangkan dengan Buffer
HEPES (pH 6,8 dan konsentrasi 0,01 M), dan dikalibrasi.

2. Native PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Metode ini dilakukan menurut NativePAGE™ Bis-
TrisManual Gel dari Novex® oleh Life Technologies Semua
buffer disimpan pada suhu 4 ◦C sebelumnya ke persiapan
sampel.
 Metode Penelitian
3. Shotgun Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)
Eksperimen ini dilakukan bekerja sama dengan
FungsionalGenomics Center Zurich (FGCZ) menggunakan teknik
Shotgun LiquidKromatografi-Spektrometri Massa (LC-MS).
Proteomik senapanmengkombinasikan Liquid Chromatography
(LC) dengan coupled tandem Mass Spektrometri (MS), ini sangat
cocok untuk menganalisis kompleks campuran protein.

4. Supernatants and pellets from 95:5 and ratio 1:1.

• TCA precipitation (supernatant samples)
• Protein digestion (pellet samples)
• Protein digestion
 Metode Penelitian

5. Analisis statistik
untuk membandingkan pengendapan protein tertentu
yang menarik dalam air liur:Campuran PPI dengan rasio 95:5 dan
1:1
 Hasil & Pembahasan
Kromatografi Ekslusi Ukuran
Metode ini berfungsi untuk memisahkan protein dan kompleks protein yang
terbentuk dalam campuran saliva:PPI yang berbeda dalam kondisi asli. Puncak
pertama dalam kromatogram SEC mewakili volume kosong, yaitu molekul yang
terlalu besar untuk masuk ke kolom.

Untuk PPI saja, puncak pertama yang

terbesar, artinya mengandung sebagian
besar protein dalam sampel. Protein
kacang terutama terdiri dari globulin. Oleh
karena itu, kemungkinan puncak ini
mencerminkan adanya kompleks protein
atau agregat protein yang mengandung
globulin kacang polong.
 Hasil & Pembahasan
Untuk air liur saja, puncak terbesar muncul
pada volume elusi yang jauh lebih besar (20
mL), yang mewakili MW sekitar 14 kDa.
Dengan demikian, puncak ini bisa sesuai
dengan Cystatins

Protein atau agregat protein ini

kemungkinan besar terlibat dalam
interaksi antara protein kacang polong
dan protein saliva, diendapkan dan
ditemukan dalam pelet sampel.
Protein Ditemukan dalam Pelet dan Supernatan
melalui LC-MS

Gambar ini menunjukkan

fluks pengendapan dari 14
protein kacang paling
melimpah yang diendapkan
dalam :campuran PPI pada
rasio 1:1 dan rasio 95:5 jika
dibandingkan dengan kontrol
negatif. Protein ini mencakup
sekitar 70% dari semua
protein yang teridentifikasi
pada rasio 1:1 dan 60% pada
rasio 95:5.
Dampak Rasio

Gambar ini menunjukkan fluks

presipitasi dari 26 protein yang
paling melimpah yang
diendapkan dalam dua rasio
penelitian air liur:campuran PPI
(1:1 dan 95:5). Bersama-sama,
protein ini mencapai 80% dari
total protein yang diendapkan
dalam rasio 1:1, dan 71% dalam
rasio 95:5
 Analisis Native-PAGE

Gambar ini menunjukkan

gel yang dihasilkan, di
mana protein utama dalam
kacang polong (Legumin,
Convicilin, Vicilin) terlihat
dalam bentuk aslinya
dalam sampel PPI saja
dengan MW masing-masing
370, 250 dan 188 kDa
(Tzitzikas et al., 2006 ).

Gambar 5. Gel elektroforesis gel poliakrilamida asli dari air liur saja, isolat protein
kacang polong (PPI) dan pelet campuran air liur:PPI pada rasio 1:1
dan kontrol negatif (NC)
 Analisis Native-PAGE

Gambar ini menunjukkan 25 protein kacang yang

diidentifikasi dalam pita 180 dan 310 kDa.
 Analisis Native-PAGE

Gambar ini menjelaskan tidak ada protein saliva yang terdeteksi pada pita 60 kDa,
yang selanjutnya menunjukkan bahwa tidak ada agregat yang melibatkan protein
saliva yang terbentuk pada BM ini. Lima dari protein saliva yang paling banyak
terdeteksi sebelumnya telah dikaitkan dengan astringency termasuk Lactotransferrin
 KESIMPULAN
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi protein kacang
polong dan saliva yang terlibat dalam pembentukan endapan yang dihasilkan
ketika PPI dan saliva dicampur. Terlihat bahwa sebagian besar protein kacang yang
teridentifikasi yang diendapkan dengan adanya air liur, juga terjadi pada kontrol
negatif (buffer HEPES), yang berarti pengendapan mereka tidak secara eksklusif
dipicu oleh air liur dan dapat didorong oleh agregasi sendiri. Namun, dapat
disimpulkan bahwa pengendapan protein ini lebih tinggi dengan adanya air liur.
Meskipun presipitasi pada kontrol negatif tidak dinilai secara kuantitatif, analisis
presipitasi antara dua rasio yang dipelajari, menunjukkan bahwa ketika lebih
banyak air liur hadir, protein ini cenderung lebih banyak mengendap. Hal ini
membuktikan bahwa protein saliva berperan aktif dalam presipitasi protein kacang
polong
 KESIMPULAN

Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah menunjukkan untuk

pertama kalinya bahwa protein kacang polong dan air liur dapat
membentuk kompleks dan endapan, yang mungkin bertanggung jawab
atas persepsi astringensi. Temuan ini menjadi dasar penelitian masa depan
yang harus fokus pada konfirmasi peran protein kacang polong yang
teridentifikasi dalam persepsi astringency dengan pemurniannya dan
analisis sensorik selanjutnya. Selanjutnya, dalam analisis protein silico
dapat memungkinkan untuk mendeteksi karakteristik struktural umum
yang dimiliki bersama antara protein dan memberikan wawasan yang
lebih dalam tentang asal molekul mekanisme astringency.
 M

Terima Kasih W