Capillary

Electrophoresis
 Anggota Kelompok

01 Chintiara Wilona 04 Lucky Laksmana

Zefanya H031211028
H031211004
Putri Hani Rania
02
Anggreini Putri 05 Hasyim
Paembonan
H031211010 H031211032

Lola Gloria Geornata

03 Achmad Adhil
06 H031211042
Machmur
H031211017
Zurin
07 H031211063
01
Pengertian dan Prinsip Kerja
(Elektroforesis Kapiler)
 Apa itu Elektroforesa?

Elektroforesa adalah metode pemisahan

yang berdasarkan pada perbedaan
kecepatan migrasi spesies yang
bermuatan dalam larutan buffer yang
diberikan medan listrik de kepadanya.
 Apa itu Capillary Electrophoresis?

Elektroforesis kapiler adalah

metode elektroforesis yang
digunakan untuk memisahkan asam
amino, protein, lipid, karbohidrat,
dan nukleotida dengan resolusi
tinggi yang dilakukan pada
pipa kapiler berisi buffer.
 Apa itu Capillary Electrophoresis?

Elektroforesis kapiler adalah bagian dari teknik

pemisahan analitis yang telah melihat aplikasi
luas, mulai dari analisis klinis, lingkungan,
makanan, dan forensik senyawa spesifik hingga
pengukuran genomik, proteomik, dan
metabolomik dari sejumlah besar analit serupa.
 Prinsip Kerja

Elektroforesis kapiler berdasarkan pada perbedaan kecepatan ion analit

bermigrasi dibawah pengaruh medan listrik. Jadi teknik ini hanya dapat
digunakan untuk analit-analit yang berupa ion dalam media buffer dalam
kapiler. Analisis elektroforesis kapiler bergantung pada prinsip bahwa
molekul memiliki muatan listrik yang berbeda dan bobot yang berbeda.
Dengan demikian, ketika molekul dalam substrat terkena medan listrik,
molekul yang berbeda akan bergerak ke arah yang berbeda dan pada
kecepatan yang berbeda dalam substrat.
Skema Elektroforesis Kapiler
Abstrak
02
Aplikasi
(Elektroforesis Kapiler)
 Alat dan Bahan

• Alat
Elektrodamikro-band boron-doped diamond,
• Bahan
Adenosina monofosfat (AMP), Adenosin difosfat (ADP), Adenosina trifosfat
(ATP), kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), dikalium fosfat (K2HPO4), asam
fosfat (H3PO4), asam asetat (CH3COOH), asam borat (H3BO4), dan
metanol
 Metode

1. Persiapan dan Karakterisasi Elektroda Micro-band BDD

BDD polikristalin disiapkan menggunakan sistem
pengendapan uap kimia dengan bantuan plasma gelombang
mikro (MPCVD, CORNES Technologies/ ASTeX−5400). Film
polikristalin diendapkan pada pelat Si (100) dari larutan metanol
yang mengandung boron dengan rasio B ke C 1% (1% BDD). Film
polikristalin rata-rata berukuran sekitar 5 μm.
 Metode
Sebelum dimodifikasi sebagai micro-band, substrat silikon
dihilangkan dari BDD dengan merendam film polikristalin BDD dalam
campuran HF (48%) dan HNO3 (60%) (1:1) selama 12 jam. Elektroda
mikro-band kemudian disiapkan menggunakan laminasi. BDD dan
karet silikon dipotong menjadi kotak berukuran 1 cm. Kemudian,
dengan dukungan Teflon, lapisan seperti sandwich selebar 4 mm
terbentuk dengan urutan Teflon-silicone-BDD-silicone-Teflon. Kawat
tembaga dimasukkan untuk memberikan kontak listrik.
 Metode
2. Pengukuran Elektrokimia Adenosin Fosfat
Dilakukan dengan menggunakan voltametri siklik pada kisaran
potensial –1,6 V hingga +2,0 V untuk mempelajari perilaku elektrokimia
AP. BDD mikro-band buatan dan sistem Ag/AgCl masing-masing
digunakan sebagai elektroda kerja dan referensi, sedangkan elektroda
platinum digunakan sebagai elektroda lawan. Berbagai konsentrasi
larutan tunggal dan campuran adenosin fosfat (AMP, ADP, dan ATP)
disiapkan dalam larutan buffer fosfat (PBS) pada pH 6,8.
 Metode

Pengaruh pH dipelajari dalam buffer Britton–Robinson yang

mengandung 0,04 M H3PO4, 0,04 M CH3COOH, dan 0,04 M H3BO4.
Untuk mengatur pH, digunakan 0,02 M NaOH. Kemudian, aplikasi
menggunakan sistem elektroforesis kapiler dilakukan dengan
menggabungkan sistem elektroforesis kapiler dengan potensiostat.
Amperometri diterapkan pada berbagai tegangan pemisahan dari
5 kV hingga 25 kV dan dengan berbagai konsentrasi AP (0,1 mM
hingga 2 mM) dalam larutan.
Metode
 Metode
3. Menggunakan Elektroforesis Kapiler untuk Mengambil Sampel Urin
Manusia
Sampel yang baru diambil dari Laboratorium Kimia Organik
dan Biokimia, Departemen Kimia Universitas Indonesia, awalnya
disaring menggunakan filter nilon 0,45 µm. Sampel kemudian
dicampur dengan PBS pH 6,8 dengan perbandingan 1:1. Pengukuran
dilakukan menggunakan elektroforesis kapiler untuk menganalisis
komposisi senyawa adenosin fosfat dalam urin manusia dengan
metode amperometri.
 Prosedur Kerja
BDD polikristalin disiapkan dengan menggunakan sistem pengendapan
uap kimia dengan bantuan plasma gelombang mikro yang diendapkan
pada plat silikon yang berukuran sekitar 5 µm. Sebelum dimodifikasi
menjadi micro band, substrat silikon dihilangkan dari BDD dengan
direndam pada campuran HF dan HNO3 selama 12 jam, lalu diberikan
kawat tembaga untuk memberikan kontak listrik. Diukur eletrokimia
menggunakan voltametri siklik pada kisaran -1,6 V hingga +2,0 V.
Disiapkan larutan tunggal dan campuran adenosin fosfat dalam larutan
buffer fosfat pada pH 6,8. Lalu, aplikasi menggunakan sistem
elektroforesis kapiler dengan menggabungkannya dengan potensiostat.
Diambil sampel urin manusia, awalnya disaring dengan filter nilon 0,45
µm lalu sampel dicampur dengan buffer fosfat pH 6,8 dengan
perbandingan 1:1, lalu diukur menggunakan elektroforesis kapiler untuk
menganalisis komposisi senyawa adenosin fosfat dalam urin manusia
 03
Hasil &
Pembahasan
 Hasil & Pembahasan
3.1 Karakterisasi Mikro-band Boron-doped
Diamond Electrode
Kualitas BDD polikristalin diperiksa
menggunakan spektroskopi Raman. Gambar 1a
menampilkan spektrum Raman dari elektroda
BDD. Intensitas relatif sekitar 1332 cm-1
berhubungan dengan berlian kristalinitas tinggi
dengan struktur C-C di sp3 hibridisasi. Tidak
adanya puncak sekitar 1500 cm-1 menunjukkan
bahwa lapisan polikristalin BDD bebas dari
pengotor yang disebabkan oleh struktur C-C
pada sp2 hibridisasi.

Gambar 1: (a) Spektrum Raman dari elektroda BDD

dan (b) XPS dari elektroda BDD
 Hasil & Pembahasan
Gambar 2: Gambar (a) SEM elektroda BDD mikro-band sebelum
fabrikasi dan (b) SEM elektroda BDD mikro-band setelah fabrikasi.
Inset pada (a) menunjukkan butiran film polikristalin BDD
Gambar 2 menunjukkan gambar SEM
dari elektroda mikro-band BDD. Gambar
2a menampilkan bagian longitudinal
elektroda. Ketebalan BDD di elektroda
mikro-band sekitar 10 μm. Butir partikel
homogen pada permukaan BDD diamati
berukuran ±4-5 µm, seperti yang
ditunjukkan pada inset Gambar 2a.
Lapisan elektroda mikro-band BDD
ditunjukkan pada Gambar 2b. Gambar
tersebut menunjukkan beberapa sisi gelap
sebagai celah dari cacat delaminasi dalam
proses seperti pencucian dan pengeringan,
dan selama percobaan.
 Hasil & Pembahasan
3.2 Elektrokimia AMP, ADP, dan ATP pada
Elektroda Micro-band BDD Sifat elektrokimia AP diselidiki dengan
menggunakan voltametri siklik dalam
larutan buffer PBS pada pH 6,8.
Voltammogram siklik (CVs) AMP,
ADP, dan ATP masing-masing
ditunjukkan pada Gambar 4a, 4b, dan
4c. CVs menunjukkan bahwa puncak
oksidasi adenosin fosfat biasanya
sekitar +0,9 V. Dengan demikian,
potensial +1,0 V dipilih sebagai arus
optimal dalam penelitian ini, dengan
asumsi bahwa semua adenosin telah
Gambar 3: Voltammogram siklik larutan buffer fosfat pH 6,8 teroksidasi sempurna pada potensial ini.
dengan tidak adanya dan dengan adanya AMP (a); ADP (b);
dan ATP (c)
 Hasil & Pembahasan

Gambar 3: bersama dengan plot ketergantungan arus (d) dan potensial (e) vs. pH AM, ADP, dan AMP
Pengaruh pH diperiksa lebih lanjut menggunakan buffer Britton–Robinson dengan pH berkisar
antara 2,0 hingga 10,0. Gambar 3c menunjukkan bahwa perubahan pH mempengaruhi potensial
Oksidasi AP serta perubahan arus puncak. Dari pH 2 hingga pH 4, potensi oksidasi menurun, dan
jenuh hingga pH 10. Kemiringan sekitar -59 mV/pH dari pH 2 hingga pH 4 untuk semua AP
menegaskan hasil sebelumnya. Ini berarti bahwa proses oksidasi melibatkan jumlah elektron dan
proton yang sama, seperti yang dinyatakan oleh persamaan Nernst. Selain itu, arus oksidasi AP
tertinggi diamati pada pH 2, karena adanya satu atau lebih gugus fosfat dari AMP, ADP, dan ATP
menghasilkan muatan negatif dan mempengaruhi interaksi dengan elektroda dalam larutan asam.
Oleh karena itu, pH 2 dipilih untuk percobaan berikutnya.
 Hasil & Pembahasan
3.3 Pemisahan AMP, ADP, dan ATP dalam Elektroforesis Kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode pemisahan bahan kimia yang didasarkan
pada pergerakan ion atau partikel bermuatan dalam larutan ketika arus listrik dialirkan.
Elektroforesis kapiler adalah metode pemisahan kinerja tinggi karena migrasi elektroforesis
diferensial dari partikel bermuatan listrik, yang dipengaruhi oleh ukuran dan muatannya.
Menghubungkan elektroforesis kapiler dengan detektor dapat digunakan untuk metode
analisis kinerja tinggi. Sistem ini menggunakan satu daya tegangan tinggi dengan dua
kutub. Di kutub positif dipasang sistem detektor, dan di kutub negatif dipasang tempat
sampel. Oleh karena itu, ion bermuatan negatif tertarik ke detektor. Semakin negatif ionnya,
semakin cepat pergerakannya ke detektor. Atom oksigen dalam gugus fosfat AP diketahui
memberikan muatan negatif. Dengan demikian, ATP yang memiliki tiga bagian fosfat,
bergerak lebih cepat, diikuti oleh ADP dan AMP.
 Hasil & Pembahasan
Gambar 4: Pengaruh tegangan separasi: (a) 5 kV; (b) 10 kV;
(c) 12 kV; (d) 15 kV; (e) 20 kV; dan (f) 25 kV dalam
elektroforesis kapiler pada masing-masing larutan 0,1 M untuk
ATP, ADP, dan AMP dalam buffer Britton–Robinson pH 2.0.
Elektroda BDD mikro-band digunakan sebagai detektor dengan
deteksi amperometri pada +1,0 V (vs. Ag/AgCl)
Pengaruh tegangan pemisahan dalam elektroforesis
kapiler diperiksa dengan menerapkan berbagai
tegangan pemisahan dari 5 kV hingga 25 kV
selama 30 menit dengan amperometri pada +1,0 V
yang digunakan dalam detektor. Gambar 4a
menunjukkan bahwa tidak ada puncak yang
muncul saat 5 kV diterapkan. Ini berarti lebih
banyak waktu diperlukan untuk menarik AP.
Tegangan pemisahan yang lebih tinggi diperlukan
untuk mencapai waktu migrasi yang lebih pendek,
seperti yang ditunjukkan oleh elektropherogram
menggunakan tegangan pemisahan 10 k pada
Gambar 4b. Di sana, tiga puncak pada 110 detik,
1500 detik, dan 1800 detik diamati. Namun,
tegangan pemisahan di atas 10 kV menghasilkan
pemisahan yang tidak lengkap pada gambar 4c
hingga 4f. Oleh karena itu, 10 kV dipilih untuk
percobaan selanjutnya.
Hasil & Pembahasan
Gambar 5: Deteksi amperometri elektrolisis kapiler
dengan tegangan pemisahan 10 kV dalam larutan dengan
berbagai konsentrasi: (a) AMP; (b) ADP; (c) ATP; dan
(d) campuran AMP, ADP, dan ATP

Pengaruh berbagai konsentrasi dalam elektroforesis kapiler

dengan menerapkan tegangan pemisahan 10 kV dipelajari
menggunakan larutan individu AMP, ADP, dan ATP serta
larutan dari tiga AP pada konsentrasi yang berkisar dari 0,1
mM hingga 2 mM. Gambar 5 dan Tabel 1 menunjukkan
linearitas arus yang baik, diukur dalam sistem
elektroforesis kapiler dengan r2 sekitar 0,99. Selanjutnya,
elektroforesis kapiler dari larutan AMP, ADP, dan ATP
menunjukkan bahwa ketiga AP dipisahkan dengan baik
dengan linearitas yang baik. Batas deteksi (LOD) dari
setiap AP yang diperkirakan oleh sistem masing-masing
adalah 0,04 μM 0,06 μM, dan 0,011 μM, untuk AMP, ADP,
dan ATP dalam larutan.
 Hasil & Pembahasan

Sementara itu, sensitivitas sistem yang

Gambar 6: Kurva kalibrasi AMP, ADP, dan ATP diekstraksi
dengan elektrolisis kapiler menggunakan tegangan
pemisahan 10 kV pada: (a) micro-band BDD; dan (b)
elektroda BDD makro
menggunakan elektroda mikro-band dan
elektroda BDD normal (makro) dibandingkan.
Sensitivitas ditentukan oleh gradien kurva
kalibrasi untuk AMP, ADP, dan ATP. Hal ini
menunjukkan bahwa elektroda mikro-band BDD
lebih sensitif daripada elektroda makro BDD.
 Hasil & Pembahasan

Gambar Tabel: Performa analitik elektroforesis kapiler yang dikembangkan untuk pengukuran
ATP, ADP, dan AMP menggunakan microband BDD dibandingkan dengan makroelektroda
BDD normal
 Hasil & Pembahasan
Sensitivitas mikroelektroda dapat dijelaskan dengan proses difusi yang terjadi dari larutan
ruah ke permukaan elektroda. Makroelektroda memiliki difusi linier, sedangkan
mikroelektroda memiliki difusi radial. Dengan makroelektroda, arus berkurang dari waktu
ke waktu karena proses difusi liniernya. Oleh karena itu, dibutuhkan lebih banyak waktu
bagi molekul untuk berdifusi ke permukaan elektroda. Akibatnya, kondisi steady state
menjadi lebih sulit dicapai. Di sisi lain, dengan mikroelektroda, karena lapisan difusi
bergerak keluar menuju larutan curah dan memperbesar area batas lapisan difusi, laju dan
fluks arus yang dihasilkan oleh elektroda meningkat secara drastis. Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa mikroelektroda jauh lebih sensitif daripada makroelektroda.
 Hasil & Pembahasan
3.4 Aplikasi untuk Analisis Sampel Nyata Analisis sampel nyata dilakukan dengan sampel urin
Gambar 7: Elektroforetogram sampel urin manusia
manusia yang dibubuhi 0,1 mM konsentrasi AMP,
ADP, dan ATP untuk mempelajari respons
elektrokimia. Adenin dan guanin pada konsentrasi
yang sama juga ditambahkan. Gambar ini
menunjukkan bahwa sistem mendeteksi beberapa
puncak pada sekitar 500 detik, 670 detik, 1100 detik,
1300 detik, dan 1600 detik. Ini didefinisikan sebagai
adenin, guanin, ATP, ADP, dan AMP, masing-masing.
Selanjutnya, persentase pemulihan adenin, guanin,
AMP, ADP, dan ATP dihitung masing-masing sebesar
99,2%, 102,5%, 107,4%, 107,7%, dan 105,4%.
Hasilnya menunjukkan bahwa sistem dapat
digunakan untuk aplikasi nyata.
04
Kelebihan &
Kekurangan
 Kelebihan :

• Metode pemisahan elektrolisis cukup dengan peralatan

sederhana dan digunakan untuk pemisahan sempel molekul
besar
• Pemisahan dengan linieritas yang baik
 Kekurangan :

Memiliki keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah,

waktu pemisahan yang relatif lama dan berlaku untuk senyawa
yang berwarna saja. Faktor penyebabnya biasanya karena arus
searah yang relatif rendah, kecepatan pemisahan tergantung
pada penambahan tekanan listrik searah. Selain itu, tegangan
listrik yang searah dapat menyebabkan noda hasil pemisahan
menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang
dihasilkan tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-
noda hasil pemisahan elektroforesis menjadi tidak terlalu jelas
memisah.
Kesimpulan
 Kesimpulan

Elektroda BDD mikro-band dengan permukaan efektif 1,11x10-7M2 berhasil dibuat

dengan laminasi yang menggunakan Teflon dan silikon sebagai pelat isolasi. Studi
voltametri siklik AMP, ADP, dan ATP menunjukkan bahwa parameter optimal
untuk deteksi elektrokimia berada pada potensi +0,9 V dan pH 2,0.
Mempekerjakan elektroda untuk elektroforesis kapiler dapat dilakukan secara
bersamaan pada larutan AMP, ADP, dan ATP dengan korelasi linier antara arus
oksidasi dan konsentrasi. Hasil menunjukkan bahwa sistem menjanjikan aplikasi
nyata untuk deteksi simultan adenosin fosfat. Oleh karena itu, penyelidikan lebih
lanjut pada proses pembuatan elektroda BDD mikro-band, serta parameter optimal
yang digunakan dalam sistem CE, sangat penting untuk meningkatkan efektivitas
elektroda BDD yang dimodifikasi sebagai detektor adenosin.
Terima Kasih